《Nature Methods》新型 FRET 生物传感器实现 PTEN 活性在体内的高分辨动态成像

为解决无法在完整生物系统中直接监测 PTEN 活性的问题，特拉维夫大学研究人员开展基于 FRET 的生物传感器相关研究。他们开发出能在体内动态成像 PTEN 活性的传感器，这对探究相关疾病机制和开发疗法意义重大，推荐科研读者阅读。

　　

在细胞的世界里，有一个 “大管家”，它就是 PTEN（磷酸酶和张力蛋白同源物）。这个 “大管家” 可不简单，它对细胞的生长、增殖和存活起着至关重要的调控作用。它就像一个精密的刹车系统，通过对磷脂酰肌醇 3,4,5 - 三磷酸（PIP3）进行去磷酸化，抑制下游丝氨酸 / 苏氨酸激酶（Akt）的激活，从而控制细胞的各种活动 。在大脑这个神秘的 “王国” 中，PTEN 更是身兼数职，它参与协调神经元和神经胶质细胞的发育、调节突触可塑性、引导轴突生长等。

然而，当这个 “大管家” 出现问题时，麻烦就来了。PTEN 功能缺失突变与多种人类疾病密切相关，像系统性肿瘤、神经发育障碍（如自闭症谱系障碍、癫痫）等。打个比方，如果把细胞比作一辆行驶的汽车，PTEN 就是刹车，当刹车失灵（PTEN 功能缺失），汽车就可能会失控，引发各种 “事故”（疾病） 。

尽管 PTEN 如此重要，但科学家们在研究它的时候却遇到了难题。目前，评估 PTEN 功能的方法十分有限。现有的方法要么只能进行间接的生化检测，就好比只能通过观察汽车周围的痕迹来推测刹车是否好用；要么就是对 PTEN 进行基因操作，但这就像直接大修汽车的刹车系统，会严重干扰细胞的正常功能，让细胞这辆 “汽车” 无法正常行驶 。而且，在完整的细胞、组织和生物体中，PTEN 信号活动的精确动态变化仍然是个未解之谜。就好像汽车在行驶过程中，刹车的实时工作状态我们并不清楚。所以，开发一种能够在完整生物系统中直接监测 PTEN 活性的方法，就成了科学家们亟待解决的问题。

为了攻克这个难题，来自以色列特拉维夫大学的研究人员经过不懈努力，在《Nature Methods》期刊上发表了一篇名为 “Imaging PTEN activity in vivo using FRET - based biosensors and two - photon FLIM” 的论文。他们成功开发出了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器，并结合双光子荧光寿命成像显微镜（2pFLIM），实现了在体内对 PTEN 活性的动态成像，就像是给细胞这辆 “汽车” 的刹车系统装上了一个实时监控器，能随时观察刹车的工作状态。这一成果为深入研究 PTEN 在生理和病理过程中的作用提供了强大的工具，对理解相关疾病的发病机制和开发新的治疗方法具有重要意义。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键的技术方法。首先是基于 FRET 原理设计生物传感器，利用 PTEN 激活时的构象变化，在 PTEN 的 N 和 C 末端分别标记供体和受体荧光蛋白，通过 FRET 来检测其构象变化，以此作为 PTEN 活性的指标 。其次是 2pFLIM 技术，它能够在复杂的组织环境中对生物传感器的活性进行可靠的定量检测，不受荧光波动和传感器表达水平的影响。最后，研究人员还利用了基因编辑技术（如 CRISPR - Cas9）来操纵相关基因，研究其对 PTEN 活性的影响。

下面来看看研究人员都有哪些令人惊喜的发现吧。

开发新的 PTEN FRET/FLIM 生物传感器

研究人员的目标是开发一种能在活细胞中监测 PTEN 活性的生物传感器。他们知道 PTEN 激活时会从封闭状态转变为开放状态，于是巧妙地在 PTEN 的 N 和 C 末端分别连接上供体荧光蛋白（单体增强型绿色荧光蛋白 mEGFP ）和受体荧光蛋白（暗黄色荧光蛋白变体 sREACh）。这样，当 PTEN 构象发生变化时，就会引起 FRET 效率改变，通过 2pFLIM 测量 GFP 的荧光寿命，就能反映 PTEN 的活性。为了找到最佳的传感器设计，他们对连接区域进行了优化。实验发现，优化后的传感器在基础状态下有较高的 FRET 水平（低荧光寿命），而当 PTEN 的四个磷酸化位点突变为丙氨酸（4A 突变）时，FRET 值显著降低 。用四溴苯并三唑（TBB，一种能抑制磷酸化 PTEN 的激酶 CK2 的物质）处理细胞，传感器的荧光寿命会延长，说明 PTEN 活性增加；用表皮生长因子（EGF，能负向调节 PTEN 活性）处理，荧光寿命则缩短。此外，过表达组成型活性形式的 RhoA（一种能调节 PTEN 上游信号的蛋白）会增加荧光寿命，即激活 PTEN，而显性负突变的 RhoA 则无此作用。这一系列实验表明，该生物传感器能够可靠地监测活细胞中 PTEN 的构象和活性变化。

PTEN 传感器对致病突变的敏感性

PTEN 信号的改变与许多疾病相关，这些疾病往往和 PTEN 的功能缺失突变有关。研究人员想知道不同的 PTEN 致病突变对基于构象的 PTEN 生物传感器有什么影响。他们在生物传感器中引入了七种与人类癌症和自闭症相关的点突变，然后在 HEK293 细胞中表达这些突变体，并使用 2pFLIM 检测荧光寿命。有趣的是，这些点突变导致的荧光寿命变化范围很大。一些突变，如 R173P 和 R130P，会使荧光寿命大幅增加，这意味着 PTEN 的紧密封闭形式完全丧失或不稳定。通过计算突变对蛋白质稳定性的影响（预测 ΔΔG ），他们还发现荧光寿命差异与预测的稳定性之间存在很强的相关性。这表明，这种基于 FRET 的方法能够高度灵敏地检测出由 PTEN 致病突变引起的结构异常，使得该生物传感器适合用于系统地表征新的 PTEN 突变。

PTEN 生物传感器对内源性信号干扰最小化

虽然生物传感器开发出来了，但研究人员还面临一个问题，那就是 PTEN 过表达可能会干扰细胞功能。为了解决这个问题，他们筛选了不同的 PTEN 功能缺失点突变，最终发现 R14G 突变体在基础荧光寿命、亮度和表达方面与野生型 PTEN 相似。进一步研究发现，R14G 突变体的 PTEN 传感器在体外几乎没有磷酸酶活性，而且过表达该突变体不会影响细胞形态（如在 HEK 细胞和神经元中），也不会干扰下游信号通路（如通过检测磷酸化 Akt（pAkt）水平验证）。在体内实验中，过表达 R14G 突变体的 PTEN 传感器对神经元的自发活动没有影响，而野生型 PTEN 传感器则会显著降低神经元活动。此外，R14G 突变体不会像一些突变体那样产生显性负效应。因此，含有 R14G 的 PTEN 传感器（G - PTEN）是评估 PTEN 活性状态的可靠探针，过表达它不会改变下游 PTEN 信号，也不会干扰细胞的结构和功能。

监测秀丽隐杆线虫发育过程中的 PTEN 信号

为了在完整的神经系统中评估 G - PTEN 传感器的性能，研究人员选择了秀丽隐杆线虫作为实验模型。秀丽隐杆线虫的 PTEN 同源基因 daf - 18 在代谢、发育和寿命等方面起着关键作用。研究人员将 PTEN R14G 传感器克隆到神经元特异性启动子 Psnb - 1 下，并注射到秀丽隐杆线虫中，获得了泛神经元表达的转基因线虫。通过 2pFLIM 测量发现，用 TBB 处理线虫后，神经元 PTEN 的荧光寿命显著增加，说明 PTEN 活性增强。而且，在秀丽隐杆线虫从 L1 期到成虫的发育过程中，PTEN 活性逐渐增加，在 L4 期达到稳定。有趣的是，抑制胰岛素样生长因子 1 受体（IGF1R）的同源基因 daf - 2 会使 PTEN 活性大幅增加，并且这种增加在整个发育过程中都保持稳定。这些结果验证了 PTEN 生物传感器在秀丽隐杆线虫中直接可视化 PTEN 信号的实用性，同时也揭示了 daf - 2 和 PTEN 之间存在直接的相互作用。

小鼠大脑中 PTEN 的体内成像

研究人员想知道在小鼠大脑中能否也实现对 PTEN 活性的监测。他们通过子宫内电穿孔（IUE）技术，将 G - PTEN 传感器稀疏地表达在小鼠 L2/3 运动和躯体感觉皮层中。在成年小鼠进行颅骨窗手术后，利用 2pFLIM 进行成像。结果发现，G - PTEN 传感器的稀疏表达结合体内 2pFLIM，能够在神经元细胞体、单个树突和树突棘中以超高的亚细胞分辨率监测 PTEN 活性。而且，神经元细胞体的 PTEN 活性高于树突区域，这表明 PTEN 活性在体内存在区域化差异。为了探究 PTEN 信号通路关键基因的变化对 PTEN 活性的影响，研究人员利用 CRISPR - Cas9 技术共表达 G - PTEN 与靶向 IGF1R 或 Tsc2 的质粒。结果发现，敲低 IGF1R 和 Tsc2 会使 PTEN 活性在细胞体和树突中的表现不同，同时伴随着细胞形态和树突棘密度的改变。这说明通过体内成像可以识别出在操纵上游或下游信号后，突触和体细胞中 PTEN 活性的亚细胞差异。

用红移 PTEN 传感器对 PTEN 活性进行双成像

为了能够同时监测 PTEN 活性和神经元活动，研究人员开发了一种红移的 PTEN 传感器（R - PTEN）。他们用之前开发的适用于 2pFLIM 的 FRET 对（mCyRFP2 和 mMaroon1）分别替换 G - PTEN 传感器中的 mEGFP 和 sREACh 。实验表明，R - PTEN 保留了对 PTEN 活性变化的敏感性和特异性，4A 突变会增加其基础荧光寿命，TBB 处理使其荧光寿命增加，EGF 处理则使其荧光寿命降低。研究人员制备了携带 R - PTEN 的腺相关病毒（AAV），并在体内进行成像。R - PTEN 在神经元突触蛋白启动子的控制下主要在兴奋性细胞中表达，且表达量约为内源性 PTEN 的 2 倍。而且，R - PTEN 与基于 GFP 的钙指示剂 GCaMP8s 共表达时，可以用单个双光子激光激发同时成像，且两者之间没有串扰。通过测量自发神经元活动，发现 R - PTEN 阳性和阴性细胞之间没有显著差异，并且 PTEN 活性水平与自发活动呈负相关。这表明 R - PTEN 适用于体内成像，并且可以与其他生物传感器结合来探测神经元信号和活动。

同时对体内特定细胞的 PTEN 信号进行成像

最后，研究人员想探究不同细胞类型中 PTEN 活性是否存在差异。他们利用 piggyBac 载体在 L2/3 兴奋性细胞和皮质星形胶质细胞中表达 G - PTEN 生物传感器，发现星形胶质细胞的基础 PTEN 荧光寿命平均值低于神经元，且具有较高的异质性。为了研究兴奋性和抑制性细胞中的 PTEN 活性，他们采用了双色遗传策略，用 R - PTEN 主要标记兴奋性细胞，用 G - PTEN 标记抑制性细胞（通过 PV Cre 小鼠和 FLEX G - PTEN AAV ）。在小鼠出生后的关键时期（P11 - P28）进行对侧触须剥夺实验，然后用体内 2pFLIM 成像。结果发现，触须剥夺后，兴奋性细胞的 PTEN 活性略有降低，而抑制性细胞的 PTEN 活性增加。这表明感觉剥夺会导致兴奋性和抑制性神经元中 PTEN 信号的差异调节，同时成像技术揭示了不同细胞类型在感觉经验后的 PTEN 活性动态变化。

在这项研究中，研究人员成功开发并验证了一种新型的生物传感器，它能够在多种生物系统（细胞系、完整组织和整个生物体）中动态监测 PTEN 信号。通过筛选 LOF 点突变，他们得到了对内源性信号干扰最小的 G - PTEN 传感器。利用该传感器，在秀丽隐杆线虫和小鼠模型中，研究人员发现了 PTEN 活性在发育过程和不同细胞类型中的动态变化。红移传感器 R - PTEN 的开发，更是让同时监测 PTEN 活性和神经元活动成为可能。而且，研究还揭示了感觉剥夺对兴奋性和抑制性神经元中 PTEN 信号的差异调节。

这项研究成果意义重大。它为研究 PTEN 在生理和病理过程中的作用提供了有力的工具，让科学家们能够更深入地了解 PTEN 信号通路。这对于揭示相关疾病（如自闭症等神经发育障碍）的发病机制具有重要意义，也为开发新的治疗方法提供了新的思路和靶点。就好像为细胞 “大管家” PTEN 的研究打开了一扇新的大门，让我们离揭开细胞活动和疾病奥秘又近了一步。未来，随着技术的进一步优化，有望更深入地了解 PTEN 活性在各种实验生物系统中的时空动态变化，为生命科学和医学领域的发展带来更多的突破。