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为解决 WGS 临床应用中成本高、技术复杂等问题，研究人员开展 RapidONT 工作流程研究。结果显示该流程可有效分析多种病原体基因组。推荐阅读，它能让你了解创新测序流程，为临床病原体分析带来新思路。
在临床微生物学实验室里，准确地探索微生物的各种特性，对于传染病的诊断、治疗以及感染的预防和控制都极为关键。以往，人们主要通过显微镜观察微生物的颜色和形状，借助革兰氏染色等技术进行初步鉴定，再将其在培养基中分离培养 。但随着科技的进步，高通量测序技术的出现，让大规模比较细菌菌株的基因组成为可能。全基因组测序（WGS）更是凭借其超高的分辨率，在揭示细菌适应、流行病学以及耐药性等分子特征方面，展现出巨大的优势，使得传统的分子分型方法都有些相形见绌。
然而，理想很丰满，现实却很骨感。WGS 在临床应用的道路上，遇到了重重阻碍。高昂的成本、复杂的技术操作，以及数据分析时对生物信息学专业知识的高要求，都像是一道道难以跨越的关卡，严重限制了它在临床上的常规应用。就好比是给想要使用 WGS 的临床医生们，设置了层层障碍，让他们难以顺利开展工作。
为了打破这些阻碍，让 WGS 能更好地服务于临床，来自相关研究机构的研究人员进行了深入探索。他们在《Scientific Reports》期刊上发表了名为《RapidONT: a streamlined whole-genome sequencing workflow for cost-effective pathogen analysis》的论文，为解决这些难题带来了新的希望。研究人员提出了 RapidONT 工作流程，这一流程旨在实现基于 WGS 的病原体分析的经济高效和广泛可及，就像是为 WGS 的临床应用开辟了一条新的道路。
研究人员在这项研究中，运用了多个关键的技术方法。他们采用了通用的 DNA 提取方案，通过机械剪切的方式来打破细菌细胞，获取 DNA。接着，利用多重牛津纳米孔技术（ONT）快速条形码试剂盒构建文库。在基因组装环节，使用 Flye 软件进行从头组装，之后再用 Medaka 和 Homopolish 软件对组装结果进行优化。最后，借助用户友好的基于网络的平台 Pathogenwatch，完成物种鉴定、分子分型和抗菌药物耐药性（AMR）预测等分析工作。
下面来看看研究人员通过这些技术方法，都获得了哪些研究成果。
- 完整基因组的构建：研究人员为了评估 RapidONT 工作流程生成的基因组组装的完整性，通过传统工作流程构建了完整的参考基因组。他们对 89 个样本进行了基于革兰氏染色特征的 DNA 提取，运用 Unicycler 生成短读长和长读长混合组装，用 CCBGpipe 处理长读长单独组装，并经过多步精细的抛光处理。最终成功为所有 89 个样本组装出了环形基因组，这些高质量的完整基因组就像是精准的 “模板”，为后续评估 RapidONT 工作流程提供了可靠的标准。
- 纳米孔测序的实践：RapidONT 工作流程包含通用 DNA 提取、基于转座酶的快速文库构建和使用 Flye 进行从头组装这三个关键步骤。研究人员模拟真实的实验场景，用两个 MinION 流动池对 90 个细菌分离株进行纳米孔测序。经过四次测序运行，成功为目标的九种 WHO 优先病原体生成了草图组装，并通过 Medaka 和 Homopolish 进行了抛光处理。这一过程就像是搭建了一条高效的 “生产线”，快速地处理和分析细菌的基因组信息。
- 工作流程的性能评估：在对 90 个样本的研究中，只有一个测序产量极低的沙门氏菌属分离株未能成功生成 Flye 组装，还有 12 个样本在抛光过程中遇到困难。研究发现，革兰氏阴性菌株通常比革兰氏阳性菌株产生更多的序列碱基，但沙门氏菌属和粪肠球菌除外。通过研究还确定了，为保证基因组组装的完整性和准确性，最小测序深度需达到 20 倍，并且发现 Medaka 和 Homopolish 结合（m + h）的抛光方法，在减少错配和插入缺失方面效果最佳。这就好比找到了工作流程中的 “薄弱环节” 和 “最佳策略”，为后续改进和优化提供了方向。
- 不同工作流程的比较分析：研究人员将完整基因组、草图组装和抛光组装上传到 Pathogenwatch 平台进行分析。结果发现，对于大多数物种，该平台都能成功进行物种识别、MLST 分型和 AMR 预测，但也存在部分物种数据不完整的情况。在对 77 个有抛光组装的分离株的比较中，发现 RapidONT 工作流程在某些病原体组的 MLST 预测和 AMR 预测上，与传统工作流程获得的完整基因组结果高度一致。这说明 RapidONT 工作流程在这些方面有着不错的准确性和可靠性。
从研究结论和讨论部分可以看出，RapidONT 工作流程意义重大。它极大地简化了实验流程，将实验操作变得更加简便易上手，同时还显著降低了成本。通过使用通用的 DNA 提取方法和快速条形码试剂盒，研究人员实现了在一个流动池中对多个样本进行测序，并且通过重复使用流动池，进一步降低了成本。虽然该工作流程在针对沙门氏菌属和淋病奈瑟菌的研究中还存在一些不足，比如沙门氏菌属的读长短、通量低，淋病奈瑟菌的组装准确性低，但这也为后续的研究指明了方向。
此外，研究还发现了一些关键的实验参数，像平均读长至少 2000bp、测序深度 20 倍等，这些参数对于获得准确的基因组信息至关重要。这就像是为后续的相关研究提供了重要的 “指南”，让其他研究人员在开展类似工作时，有了明确的参考标准。而且，Pathogenwatch 平台虽然方便易用，但也存在一些功能上的局限性，这也为未来生物信息学工具的改进和完善提出了新的要求。
总的来说，RapidONT 工作流程为临床病原体分析和诊断带来了新的可能，它就像是一把 “钥匙”，为 WGS 在临床领域的广泛应用打开了一扇新的大门，尽管还有一些需要完善的地方，但它的出现无疑推动了相关领域的发展，让我们朝着更高效、更准确的病原体分析方向迈进了一大步。
