编辑推荐：
为探究炎症小体刺激对其他细胞信号通路的影响，凯斯西储大学医学院的研究人员开展相关研究，发现 NLRP3 炎症小体刺激使 ERK1/2 失活，导致 TTP 去磷酸化、细胞因子释放增加，且 TTP 在 IBD 患者中变化显著，值得一读。
在人体的微观世界里，炎症反应就像一场复杂的战争。免疫细胞作为 “战士”，时刻守护着身体的健康。当危险信号出现时，炎症小体（inflammasome）就会被激活，它像是免疫系统的 “警报器”，一旦拉响，会引发一系列的免疫反应。炎症小体激活后，会促使成孔蛋白 Gasdermin 家族的蛋白发生切割，最终导致一种名为细胞焦亡（pyroptosis）的程序性细胞死亡形式。在细胞焦亡过程中，细胞会释放出细胞因子（cytokine）和其他与损伤相关的分子模式，这些物质会进入细胞外环境，从而启动周围组织的免疫反应。
然而，这场 “战争” 必须受到精确的调控。如果炎症小体的功能出现异常，就会引发各种问题。功能获得性突变会导致炎症小体过度激活，进而引发一系列自身炎症性疾病，比如家族性地中海热和冷吡啉相关的周期性综合征；而炎症小体的激活不足，则会使免疫系统在面对病原体感染或疫苗接种时，无法产生足够的免疫反应。
目前，虽然科学家们对炎症小体激活引发细胞焦亡的生化途径已经有了比较深入的了解，但是对于炎症小体刺激对其他细胞信号通路的影响，仍然知之甚少。鉴于细胞信号级联反应之间存在着千丝万缕的联系，很难想象在炎症小体激活引发细胞发生剧烈生物学变化的过程中，其他信号通路能够独善其身。但到目前为止，还没有相关的研究对这一可能性进行深入探索。
为了揭开这个谜团，来自凯斯西储大学医学院（Case Western Reserve University School of Medicine）的 Meghan E. O’Keefe、Hannah C. Kondolf 等研究人员，在《Cell Reports》杂志上发表了一篇题为 “Restraint of inflammasome - driven cytokine responses through the mRNA stability protein TTP” 的论文。他们发现，NLRP3 炎症小体刺激能够迅速使 MAP 激酶 ERK1/2 失活，而这一效应与炎症小体本身并无关联。ERK1/2 失活会导致其下游底物 ——mRNA 结合蛋白 TTP 发生去磷酸化。TTP 去磷酸化后，促进 mRNA 降解的能力下降，从而导致细胞因子表达和释放增加。此外，研究还发现，在炎症性肠病（IBD）患者中，TTP 的表达显著增加，这可能是对高水平细胞因子的一种反应，也可能是机体试图限制细胞因子释放的一种补偿机制。这一研究成果为深入理解炎症反应的调控机制以及相关疾病的发病机制提供了重要的线索。
研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。通过 RNA 测序（RNA - seq）技术，他们能够全面地分析炎症小体刺激后基因表达的变化情况；利用磷酸化蛋白质组学技术，研究人员可以研究激酶活性的改变，从而了解细胞信号通路的变化；免疫沉淀和蛋白质免疫印迹技术则帮助他们检测蛋白质的磷酸化状态和表达水平的变化；细胞因子芯片技术用于比较不同细胞中细胞因子的释放水平；基因编辑技术（如 CRISPR - Cas9）被用来构建基因敲除细胞系，以研究特定基因在细胞过程中的作用。
下面让我们详细看看他们的研究结果。
RNA - seq 和磷酸化蛋白质组学揭示炎症小体刺激后 ERK1/2 失活
炎症小体激活会引发一系列复杂的生化反应，最终导致细胞焦亡。研究人员推测，炎症小体的触发在导致 caspase - 1 激活、GSDMD 切割和 IL - 1β 释放的同时，极有可能也会影响其他细胞生物学级联反应。为了验证这一推测，他们首先采用了一种全局研究方法。研究人员对人 THP - 1 单核细胞进行 RNA - seq 分析，这些细胞经佛波醇 12 - 肉豆蔻酸 13 - 乙酸酯（PMA）分化过夜后，再用尼日利亚菌素（nigericin）刺激。结果发现，与未刺激的对照组相比，有 518 个基因显著上调，343 个基因显著下调。对上调基因进行基因本体（GO）分析发现，蛋白酪氨酸 / 苏氨酸磷酸酶活性相关的基因富集，其中包括双特异性磷酸酶（DUSPs），它能够通过使丝裂原活化蛋白（MAP）激酶去磷酸化而使其失活。接着，研究人员利用磷酸激酶阵列比较了小鼠永生化骨髓来源的巨噬细胞（iBMDMs）在脂多糖（LPS）刺激和 LPS 加尼日利亚菌素处理后 37 种不同激酶的磷酸化状态。结果显示，尼日利亚菌素处理后，包括 MAP 激酶 ERK1/2 在内的几种激酶的磷酸化水平降低，这与 RNA - seq 分析中观察到的 DUSP 表达增加相吻合。
尼日利亚菌素刺激导致 ERK1/2 快速失活，且与细胞焦亡无关
MAP 激酶可以在多种模式识别受体（PRRs）的下游被激活，因此 LPS 刺激炎症小体导致 ERK1/2 强烈激活并不意外。但研究人员惊讶地发现，尼日利亚菌素处理后，ERK1/2 会发生显著失活，而且这种失活与其他 MAP 激酶（如 JNK 和 p38）的情况明显不同。为了验证磷酸激酶阵列的结果，并确定炎症小体刺激的影响是否具有细胞类型特异性，研究人员用尼日利亚菌素处理 DC2.4 树突状细胞，并在 45 分钟内进行蛋白质免疫印迹分析。结果证实，尼日利亚菌素刺激后 5 - 15 分钟内，ERK1/2 及其下游效应器 NF - κB p105 迅速去磷酸化，而其他信号通路则未受影响。随后，研究人员在 iBMDMs 中比较了尼日利亚菌素刺激对磷酸化 ERK1/2 失活时间的影响，并通过碘化丙啶（PI）摄取和乳酸脱氢酶（LDH）释放来检测细胞焦亡情况。结果发现，iBMDMs 中 ERK 磷酸化的丧失在 15 分钟时就已开始，远远早于明显的 PI 阳性或 LDH 释放，这表明 ERK1/2 失活并不依赖于孔形成或随后的细胞死亡。在原代小鼠 BMDMs 中进行同样的实验，也得到了类似的结果，证实了 ERK1/2 失活在髓系细胞中并非细胞类型特异性的，且相对于细胞焦亡发生得更快。此外，研究人员还测试了 NLRP3 炎症小体激动剂三磷酸腺苷（ATP）和 CL097，发现它们也能诱导 ERK1/2 失活，这表明这种反应是炎症小体刺激整合的结果，而不是某一种特定刺激的作用。研究人员使用多种基因敲除系统进一步排除了活性 ERK1/2 的丧失仅仅是由于细胞死亡导致的可能性。最后，研究人员考虑到线粒体功能障碍可能是导致 ERK1/2 失活的原因，因为近期研究发现线粒体破坏是多种 NLRP3 激动剂（包括尼日利亚菌素和 ATP）的共同作用。他们用电子传递链复合物 I 的抑制剂鱼藤酮和线粒体解偶联剂羰基氰 - 对 - 三氟甲氧基苯腙（FCCP）处理细胞，结果发现这两种处理都能导致 ERK1/2 去磷酸化，与尼日利亚菌素处理的效果相似。这一系列实验表明，线粒体功能的破坏或其下游后果可以在炎症小体激动剂的作用下触发 ERK1/2 失活。
DUSP6 驱动 ERK 失活
为了找出导致 ERK1/2 失活的候选磷酸酶，研究人员查阅了之前 RNA - seq 实验生成的数据。考虑到 ERK 失活的速度很快，他们专门寻找在 PMA 分化后基线水平就高表达的磷酸酶。在 THP - 1 细胞中表达的 19 种 DUSP 家族成员中，DUSP6 的表达水平最高。DUSP6 对 ERK1/2 具有特异性，能够使其去磷酸化，且对 p38 或 JNK 的去磷酸化能力有限，这与之前观察到的信号效应相符。为了评估 DUSP6 在这种情况下是否对 ERK1/2 失活负责，研究人员用 DUSP1 和 DUSP6 抑制剂 BCI 盐酸盐处理 THP - 1 细胞，并进行尼日利亚菌素刺激时间进程实验。结果发现，BCI 处理显著延迟了 ERK1/2 的去磷酸化，表明 DUSP6 至少在一定程度上对此负责。在 iBMDMs 中进行同样的实验，也观察到了类似的延迟现象。然而，由于同时发生的细胞凋亡（通过 caspase - 3 激活证明）干扰了这一结果，研究人员通过 CRISPR - Cas9 技术构建了 DUSP6 基因敲除的 iBMDMs。与野生型相比，DUSP6 基因敲除的 iBMDMs 中 ERK1/2 的失活明显减少。这些综合的药理学和遗传学数据强烈表明，DUSP6 在炎症小体激动剂刺激后 ERK1/2 的去磷酸化过程中起着重要作用。
ERK 失活对细胞有广泛影响
ERK1/2 失活不仅会导致其下游底物的磷酸化水平改变，还会对细胞产生广泛的影响。研究人员使用一种底物特异性抗体来研究 ERK1/2 失活的全局效应。该抗体能够识别具有脯氨酸 - X - 丝氨酸 - 脯氨酸（PXSP）基序的磷酸化底物，通过蛋白质免疫印迹分析发现，尼日利亚菌素处理导致 ERK1/2 失活后，ERK 底物的磷酸化水平显著下降，但并非完全消失。研究人员对可能通过细胞因子释放幅度参与先天免疫到适应性免疫偶联的底物特别感兴趣。通过对 ERK 靶标的综合数据集进行基因本体（GO）富集分析，发现 RNA 结合相关的基因集富集。他们推测，一个参与 RNA 结合的 ERK 底物可能与之前观察到的尼日利亚菌素刺激后的基因表达差异有关。在比较 RNA 结合相关的 ERK 底物基因和 RNA - seq 数据集中在尼日利亚菌素刺激 4 小时后显著上调或下调的基因时，发现只有 3 个基因重叠，其中包括编码 TTP 蛋白的 ZFP36 基因。TTP 属于锌指蛋白家族，能够结合到 mRNA 的 3' 非翻译区（UTR）中的富含腺嘌呤和尿嘧啶的元件（AUUUA）序列上，从而招募 5' 脱帽复合物或 3' 去腺苷酸化复合物，促进 mRNA 的降解。TTP 主要靶向细胞因子和趋化因子的 mRNA，在炎症的启动和消退过程中都发挥着重要作用。虽然已知 TTP 能调节细胞因子 mRNA 的稳定性，但研究人员发现不同研究中报道的 TTP 靶基因重叠较少。他们整合了多个研究的数据，发现许多 TTP 靶基因在尼日利亚菌素刺激 4 小时后显著上调，这表明 TTP 可能在炎症小体触发后在 mRNA 水平上调节细胞因子反应。
尼日利亚菌素刺激导致 mRNA 稳定性蛋白 TTP 去磷酸化
上述生物信息学分析结果表明，TTP 可能会受到炎症小体刺激的影响。为了验证这一假设，研究人员再次用尼日利亚菌素处理预处理过的 iBMDMs。通过蛋白质免疫印迹分析发现，尼日利亚菌素刺激后，TTP 的电泳迁移率在 45 分钟内发生了显著变化，这种变化与预期的多磷酸化丧失相匹配，且与 ERK1/2 活性的丧失相似，表明 TTP 的磷酸化状态发生了改变。研究人员还使用 CRISPR - Cas9 技术构建了 TTP 基因敲除的 iBMDMs，并在野生型和 GSDMD 基因敲除的背景下用表达 myc 标记的 TTP 的慢病毒载体进行重构。结果发现，尼日利亚菌素刺激后，TTP 的 PXSP 基序磷酸化丧失，同时伴随着 ERK1/2 去磷酸化和 TTP 蛋白的消失，这支持了 ERK1/2 失活时 TTP 去磷酸化并失稳的假设。为了确定 TTP 的潜在磷酸化位点，研究人员利用了一个公开可用的数据集，该数据集研究了 LPS 刺激后小鼠 BMDMs 磷酸化蛋白质组的全局变化。通过定点突变实验，他们确定了丝氨酸 220（S220）是 ERK1/2 在 TTP 上的一个磷酸化位点。
活性 TTP 的丧失促进细胞因子释放
既然发现尼日利亚菌素刺激会导致 TTP 去磷酸化，那么这种变化在细胞内有什么功能意义呢？考虑到 TTP 在促进细胞因子 mRNA 降解中的作用，炎症小体刺激时 TTP 的失活或降解可能会促进细胞因子的表达，在细胞焦亡的背景下，这很可能导致细胞因子释放增加。为了验证这一假设，研究人员使用细胞因子芯片比较了野生型和 TTP 基因敲除的 iBMDMs 在 LPS 刺激和尼日利亚菌素处理后上清液中 111 种不同趋化因子或细胞因子的水平。结果发现，TTP 基因敲除的 iBMDMs 不仅释放了更多 TTP 调节的细胞因子，而且整体细胞因子释放水平也显著增加。IL - 1β 是细胞焦亡过程中释放的关键细胞因子之一，之前的研究表明它受 TTP 调节。研究人员通过 ELISA 实验进一步验证并量化了这一发现，结果显示 TTP 基因敲除的 iBMDMs 中 IL - 1β 的释放量明显高于野生型。此外，研究人员还研究了 TTP 磷酸化对细胞因子表达和释放水平的影响。他们重点研究了 S220 位点以及 S85 周围的 S/TP 位点，这些位点都符合 ERK1/2 底物的偏好。通过 ELISA 分析发现，表达野生型 TTP 的细胞在尼日利亚菌素刺激后释放的 IL - 1β 量明显低于空载体对照组，而 S220A 突变和 5S to A 突变则显著挽救了 IL - 1β 的释放，但并未完全恢复到野生型水平，这表明这些磷酸化位点对于 TTP 的完整功能是必要的，并且可能与其他磷酸化事件协同作用。
TTP 在克罗恩病患者中显著增加
炎症小体的过度激活和细胞因子水平的升高与许多炎症性疾病相关，包括类风湿性关节炎、肝脏疾病和炎症性肠病（IBD）。在分析 TTP 靶基因时，研究人员发现其中许多基因都与 IBD 的发病机制有关。因此，他们想知道 IBD 患者中 TTP 的表达是否发生改变。通过挖掘 GSE 193677 数据集，研究人员发现 IBD 患者（包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC））炎症黏膜中 TTP 的表达相对于非炎症、位置匹配的健康对照明显增加。进一步对之前发表的大规模单细胞 RNA - seq 数据集进行分析发现，CD 患者炎症回肠组织中巨噬细胞 / 单核细胞亚群、树突状细胞和肥大细胞的频率增加，且这些细胞亚群中 TTP 的表达也存在差异。此外，TTP 的表达不仅在免疫细胞中增加，在上皮细胞和基质细胞中也上调。这表明，在炎症刺激下，TTP 的磷酸化可能整合了炎症过程中的信号通路，从而根据炎症刺激来调节细胞因子的释放和幅度。
总的来说，这项研究揭示了炎症小体刺激对细胞信号通路的广泛影响。研究人员发现 NLRP3 炎症小体刺激能够迅速使 ERK1/2 失活，进而导致 TTP 去磷酸化，最终增加细胞因子的表达和释放。这一发现揭示了炎症反应调控中的一个重要机制，为理解炎症相关疾病的发病机制提供了新的视角。此外，研究还发现 TTP 在 IBD 患者中的表达变化，这为 IBD 的治疗提供了潜在的新靶点。然而，研究也存在一些局限性。例如，ERK1/2 失活可能还有其他尚未被发现的后果，TTP 还有许多其他可能受炎症小体刺激影响的磷酸化位点，DUSP6 激活的机制及其在 mRNA 稳定性中的作用也有待进一步研究。尽管如此，这项研究仍然为后续的研究奠定了坚实的基础，有望推动对炎症反应和相关疾病的深入理解和治疗。
