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为解决鲁福霉素中 3 - 硝基酪氨酸的合成及肽合成途径问题，德国波恩大学等机构研究人员开展相关研究，发现核糖体与非核糖体肽合成途径协同生成 3 - 硝基酪氨酸。该成果为新药研发等提供新思路，值得科研读者一读。
在神秘的微生物世界里，蕴藏着无数等待人类发掘的宝藏，其中肽类天然产物（由氨基酸组成的具有生物活性的化合物）便是一大类极为重要的分子。它们不仅结构复杂多样，而且在人类医学领域有着巨大的应用潜力，比如作为抗生素来对抗各种病菌。肽类的生物合成主要有两种途径，一种是依靠非核糖体肽合成酶（NRPS）这种大型酶来组装，另一种则是通过核糖体合成后再进行修饰（RiPPs）。
以往，人们认为这两种途径就像两条平行的轨道，互不相交。而且，氨基酸的硝化修饰这种重要的化学变化，一直被认为只存在于非核糖体合成途径中。在肽类天然产物的大家族里，鲁福霉素（rufomycin）是一类非常特殊的环状肽抗生素，它对引起结核病的分枝杆菌有着强大的抑制作用，有望成为新一代抗结核药物的有力候选者。鲁福霉素中，有一个独特的 3 - 硝基酪氨酸（3-
-Tyr）残基，它对于鲁福霉素的抗菌活性起着关键作用。可这个神秘的 3 - 硝基酪氨酸到底是从哪里来的呢？这一直是困扰科学家们的谜题。过去，大家猜测它可能是通过类似于其他化合物中氨基酸直接硝化的机制合成的，但始终没有确凿的证据来支持这一假设。
为了解开这些谜团，来自德国波恩大学药物生物学研究所、澳大利亚莫纳什大学等机构的研究人员，在《Chem》期刊上发表了一篇名为 “Ribosomal pentapeptide nitration for non-ribosomal peptide antibiotic precursor biosynthesis” 的论文。他们发现，原来核糖体和非核糖体肽的生物合成途径并非毫无交集，在鲁福霉素的生物合成过程中，这两条途径紧密合作，共同创造出了这个具有强大抗菌活性的天然产物，这一发现为肽类生物合成领域带来了全新的认知。
在这项研究中，研究人员用到了多种技术方法。他们运用生物信息学分析，像在基因的海洋里 “寻宝” 一样，通过搜索特定的基因序列，寻找与鲁福霉素生物合成相关的基因；利用定点突变技术，对基因进行精准 “编辑”，改变特定的氨基酸，以此来探究基因和蛋白质的功能变化；借助蛋白质表达和纯化技术，获取足够量的纯净蛋白质，为后续研究提供材料；运用质谱分析技术，对反应产物进行 “扫描”，精确地鉴定化合物的结构和含量。这些技术就像研究人员手中的 “魔法工具”，帮助他们一步步揭开鲁福霉素生物合成的神秘面纱。
下面我们来看看研究人员都有哪些有趣的发现。
Cytochrome P450 RufO nitrates a RiPP precursor peptide
研究人员在探索新型生物合成途径时，发现了一个有趣的现象。在他们研究的菌株中，有一个细胞色素 P450 酶 RufO，它和一种参与生物芳基交联的 P450 酶 BytO 有着很高的相似度。而且，在 RufO 附近还发现了一个编码五肽的基因 bytA，这个五肽（MRYLH）很可能就是 RufO 的作用底物。
为了验证这个猜想，研究人员进行了一系列实验。他们先通过结合实验，观察 RufO 和五肽底物结合时的变化，发现 RufO 对五肽的亲和力还挺高。接着，进行催化转化实验，结果表明 RufO 并不能像 BytO 那样催化五肽发生交联反应，而是把五肽中的酪氨酸（Tyr）残基硝化了，生成了 3-
-Tyr。这可太让人意外了！就好像发现了一个原本被认为只会做一件事的 “小工匠”，居然偷偷掌握了另一种神奇的技能。
研究人员还不满足于此，他们又对五肽底物进行了各种改造，替换其中不同位置的氨基酸，看看 RufO 的 “工作表现” 会有什么变化。结果发现，当把五肽中的组氨酸（His）换成色氨酸（Trp）时，RufO 的活性居然发生了反转，不再进行硝化，而是开始催化交联反应了。这就像给 “小工匠” 换了一些材料，它就改变了工作方式，简直太神奇了！通过这些实验，研究人员确定了 RufO 能够硝化五肽底物，而且这个过程和酶的结构以及底物的氨基酸序列都有着密切的关系。
RufT module 3 A-domain accepts 3--Tyr
既然确定了 RufO 能够生成 3-
-Tyr，那么这个 3-
-Tyr 又是怎么被整合到鲁福霉素中的呢？研究人员把目光投向了鲁福霉素合成酶 RufT 的 A3 结构域。他们通过结构建模和分析发现，A3 结构域的底物结合口袋比较特殊，有一个半胱氨酸（Cys）突变成了甘氨酸（Gly），这就像是给口袋扩大了空间，能够容纳 3-
-Tyr 的硝基基团。而且，这个结构域里还有一个不寻常的赖氨酸（Lys）残基，它可以和 3-
-Tyr 发生相互作用。
为了进一步验证，研究人员构建了包含 A3 结构域的表达载体，并进行了
-ATP 交换实验。实验结果显示，A3 结构域能够以相似的速率激活 L-Tyr 和 L-3-
-Tyr，这表明它对这两种氨基酸都有 “接纳” 的能力，也就是说 3-
-Tyr 确实可以被 RufT 的 A3 结构域接受并用于鲁福霉素的生物合成。这就像是找到了鲁福霉素合成过程中的一把 “钥匙”，3-
-Tyr 能够通过这把 “钥匙” 顺利地进入到鲁福霉素的合成 “大门” 里。
Role of the BytA peptide in rufomycin biosynthesis
接下来，研究人员想知道编码五肽的 bytA 基因在鲁福霉素的生物合成中到底扮演着什么样的角色。他们以链霉菌 S. atratus S3_m208_1 为研究对象，对 bytA 基因进行了改造。他们通过同源重组的方法，删除了 bytA 基因中的一段序列，结果发现突变后的菌株失去了合成鲁福霉素的能力。这就像是拆除了鲁福霉素合成 “生产线” 上的一个关键零件，整个 “生产线” 就无法正常运转了。
但是，当研究人员向突变菌株中添加 3-
-Tyr 或者带有 3-
-Tyr 的五肽时，鲁福霉素的合成又恢复了。这说明 bytA 基因编码的五肽对于鲁福霉素的生物合成是必不可少的，它就像是鲁福霉素合成的 “原材料供应商”，没有它提供的特殊 “原材料”，鲁福霉素就无法合成。同样地，研究人员对 rufO 基因进行了突变，得到的结果和 bytA 基因突变类似，进一步证明了这个生物合成途径的重要性。
RufB is an aminopeptidase that cleaves the BytA pentapeptide 1
在鲁福霉素的生物合成过程中，3-
-Tyr 需要从五肽中释放出来，才能被用于后续的合成步骤。研究人员在鲁福霉素的基因簇中发现了一个名为 RufB 的酶，它被预测为一种丝氨酸氨肽酶。为了验证 RufB 是否参与了 3-
-Tyr 的释放过程，研究人员在大肠杆菌中表达并纯化了 RufB 蛋白，然后用它和带有 3-
-Tyr 的五肽进行反应。
通过 HPLC-MS 分析，研究人员发现 RufB 能够把五肽完全消化，释放出 3-
-Tyr。这就像是 RufB 是一个 “剪刀手”，专门负责把 3-
-Tyr 从五肽上 “剪” 下来，让它可以自由地参与到鲁福霉素的合成中去。这个发现揭示了 RufB 在鲁福霉素生物合成中的重要作用，它是 3-
-Tyr 释放过程中不可或缺的 “小助手”。
Genome mining reveals further nitrotyrosine encoding pathways
最后，研究人员想看看还有没有其他类似的生物合成途径。他们利用生物信息学工具，进行了大规模的基因组挖掘。通过搜索 NO 合酶 RufN 和细胞色素 P450 单加氧酶 RufO 的同源基因，他们发现了 19 个可能编码硝基酪氨酸生物合成的基因簇。
这些基因簇可以分为两类，一类是 rufN 和 rufO 基因重叠的，另一类是这两个基因分开的。而且，在这些基因簇中，很多都包含 NRPS 和聚酮合酶（PKS）基因，这意味着硝基酪氨酸可能会被整合到不同的天然产物中。此外，研究人员还发现，这些基因簇中编码的肽酶各不相同，有些基因簇甚至没有编码肽酶，这表明它们可能利用基因组其他地方的肽酶来完成相关的生物合成步骤。这就像是在基因的 “大森林” 里发现了许多隐藏的 “小路”，这些 “小路” 可能通向更多未知的天然产物合成途径。
综合这些研究结果，研究人员发现了鲁福霉素中 3-
-Tyr 的生物合成途径，原来是核糖体合成的五肽先被 RufO 硝化，然后被 RufB 酶切割释放出 3-
-Tyr，最后 3-
-Tyr 被 RufT 的 A3 结构域接受并整合到鲁福霉素中。这一过程展示了核糖体和非核糖体肽生物合成途径之间的协同作用，为非蛋白氨基酸在 NRPS 途径中的生物合成建立了新的范例。
这项研究的意义重大。它不仅揭示了鲁福霉素生物合成的神秘机制，还为我们打开了一扇新的大门，让我们看到了自然界中生物合成的奇妙之处。通过研究，我们知道了 P450 酶在 RiPP 途径中可以通过微小的活性位点变化来实现特定的硝化功能，这为我们理解酶的进化和功能多样性提供了重要线索。而且，研究中发现的新的生物合成途径，也为我们开发新型抗生素和其他生物活性代谢物提供了潜在的靶点和思路。就像在黑暗中点亮了一盏明灯，为未来的药物研发和生物工程领域照亮了前进的方向，让我们有机会创造出更多对抗疾病的有力 “武器”，为人类的健康事业做出更大的贡献。
