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为解决 LUAD 预后生物标志物及发病机制问题，西安交通大学第二附属医院研究人员开展 PRKG1 - AS1 在 LUAD 中作用的研究。结果发现其与预后相关且调控 DKK1 影响肿瘤进展。该研究为 LUAD 诊疗提供新思路，值得一读。
肺癌，这个 “健康杀手”，一直以来都严重威胁着人类的生命健康。在肿瘤相关死亡中，肺癌导致的死亡在女性和男性中分别占到了 23% 和 24%，大部分肺癌患者确诊时就已经是晚期，5 年生存率仅仅只有 18% 。肺腺癌（LUAD）作为非小细胞肺癌中最常见的亚型，每年在全球范围内都要夺走超过 50 万条生命。面对这样严峻的形势，找到新的、有效的诊断或预后生物标志物，就成了提高 LUAD 患者生存率的关键。
随着科技的发展，测序和基因芯片技术不断进步，越来越多的长链非编码 RNA（lncRNA）被发现。别看 lncRNA 不能编码蛋白质，它在各种癌症的发生和发展过程中可起着至关重要的作用，参与了像肿瘤转移、耐药、表观遗传等好多关键的生物学过程。而且，lncRNA 作为诊断或预后生物标志物的潜力也受到了越来越多的关注。就比如说，LncRNA PANDAR 可以作为中国癌症患者的预后生物标志物，LncRNA-D16366 在肝细胞癌的诊断和预后方面价值很大。
西安交通大学第二附属医院的研究人员一直关注着这个领域，他们发现了一个很有研究价值的 lncRNA——cGMP 依赖的蛋白激酶 I 反义 RNA 1（PRKG1-AS1）。之前的研究虽然发现它和多种癌症的预后有关，可在肺癌里，它到底有啥作用、机制是什么，还没人能说清楚。为了搞明白这些问题，研究人员在《BMC Pulmonary Medicine》期刊上发表了一篇名为《Long non - coding RNA PRKG1 - AS1 promotes the progression of lung adenocarcinoma by upregulating DKK1》的论文。他们经过一系列研究得出结论：PRKG1-AS1 在 LUAD 组织和细胞中显著上调，和患者的不良预后有关，还能通过调节 DKK1 的表达来促进 LUAD 的发生和发展，这为了解 LUAD 的发病机制提供了新的思路。
在这项研究里，研究人员用了好多技术方法来 “揪出” PRKG1-AS1 的秘密。他们从 TCGA 数据库获取了 RNA 测序数据和临床信息，用 R 软件里的 “edgeR” 包进行差异表达分析；还收集了 21 对 LUAD 和相应癌旁组织，用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测 PRKG1-AS1 的表达；基因集富集分析（GSEA）被用来探索和 PRKG1-AS1 相关的肿瘤生物学过程和信号通路；为了降低 PRKG1-AS1 的表达，他们设计了反义寡核苷酸（ASO）进行转染实验；还用了 CCK8 实验、EDU 实验、克隆形成实验、伤口愈合实验、Transwell 细胞迁移实验等方法，来研究 PRKG1-AS1 对 LUAD 细胞增殖和迁移能力的影响；最后，通过计算 Pearson 相关系数，找出和 PRKG1-AS1 共表达的基因。
下面咱们来详细看看研究都有哪些重要发现。
- PRKG1-AS1 在 LUAD 组织中过表达：研究人员通过对 TCGA 数据库里 535 个 LUAD 肿瘤组织和 59 个非肿瘤组织的 RNA 测序数据进行差异表达分析，发现 PRKG1-AS1 在肿瘤组织里明显上调。在 21 对收集的肺肿瘤和相应癌旁组织样本里，也得到了同样的结果。而且，在 SPC-A-1、H1975、A549、PC-9 和 H1299 这五种非小细胞肺癌细胞系里，PRKG1-AS1 的表达都比正常支气管上皮细胞系 BEAS-2B 要高。这就说明，PRKG1-AS1 在 LUAD 组织和细胞里都过表达。
- PRKG1-AS1 对 LUAD 患者有重要的预后价值：研究人员用 Kaplan-Meier 生存分析发现，PRKG1-AS1 表达高的 LUAD 患者预后更差。把 PRKG1-AS1 表达的中位数当作分界点，高表达组患者的中位生存期是 3.11 年，低表达组是 4.38 年，高表达组 1 年、3 年、5 年的生存率也都比低表达组低。单因素和多因素 Cox 回归分析都表明，PRKG1-AS1 是影响 LUAD 患者总生存期的独立预后因素，这意味着它很有潜力成为独立的预后生物标志物。
- PRKG1-AS1 与其他临床因素的关系：研究人员分析 TCGA 数据集后发现，PRKG1-AS1 的表达和 TNM 分期、N 分期有显著相关性，TNM 分期越靠后、有淋巴结转移（N 分期高）的患者，PRKG1-AS1 表达越高。不过，它和 T 分期、年龄、性别没有明显的统计学差异，只是 T 分期晚的患者 PRKG1-AS1 表达有升高的趋势。这说明 PRKG1-AS1 可能和肿瘤转移的关系更密切。
- PRKG1-AS1 相关的生物过程和信号通路：通过 GSEA 分析，研究人员发现 PRKG1-AS1 和好多肿瘤相关的生物过程、信号通路有关。像 “免疫反应”“NF-κB 信号通路”“受体相关信号通路”“细胞黏附”“Notch 信号通路”“组蛋白乙酰化” 等生物过程都被显著富集，KEGG 通路里 “小细胞肺癌” 和 “P53 信号通路” 也和它有关。这表明 PRKG1-AS1 和肿瘤的发展密切相关。
- PRKG1-AS1 主要定位于细胞核：研究人员先用 LncATLAS 在线数据库预测 PRKG1-AS1 的亚细胞定位，发现它主要在细胞核里发挥作用。然后，他们以 U6 和 GAPDH 为参照，在 H1299 细胞系里做了细胞核 - 细胞质 RNA 分离和 RT-qPCR 实验。结果显示，PRKG1-AS1 大部分都在细胞核里，进一步证实了它的主要定位。
- 敲低 PRKG1-AS1 抑制 LUAD 细胞增殖：研究人员把 ASO 转染到 PC9 和 H1299 细胞里，用 qRT-PCR 检测发现，ASO-80、ASO-340 和 ASO-503 都能有效降低 PRKG1-AS1 的表达。根据敲低效率，他们选了 ASO-80（ASO1）和 ASO-340（ASO2）进行后续实验。CCK8 实验发现，转染 ASO1 和 ASO2 的 H1299 和 PC9 细胞在 96 小时后活力明显下降；克隆形成实验里，敲低组的细胞克隆数比对照组少；EDU 实验也表明，敲低组的 EdU 阳性率更低。这些都说明敲低 PRKG1-AS1 能显著抑制 LUAD 细胞的增殖。
- 敲低 PRKG1-AS1 抑制 LUAD 细胞转移：研究人员建立了 PRKG1-AS1 敲低的 PC9 和 H1299 细胞模型，通过伤口愈合实验发现，敲低组细胞的迁移距离更短，愈合率更低；Transwell 细胞迁移实验也显示，敲低组迁移到下腔室的细胞数量明显减少。这就证明了敲低 PRKG1-AS1 能降低 LUAD 细胞的迁移能力，抑制肿瘤转移。
- PRKG1-AS1 与 dickkopf-1（DKK1）显著共表达：研究人员计算了 PRKG1-AS1 和蛋白质编码基因（PCGs）的 Pearson 相关系数，发现 DKK1 和 PRKG1-AS1 共表达。分析 TCGA 数据集和 21 对 LUAD 肿瘤及癌旁组织样本后，他们发现 DKK1 在 LUAD 组织里过表达，和 PRKG1-AS1 共表达。敲低 PRKG1-AS1 后，H1299 和 PC9 细胞系里 DKK1 的表达也明显下降。这表明 PRKG1-AS1 能调节 DKK1 的表达，DKK1 可能是 PRKG1-AS1 的下游靶基因。
- DKK1 对 LUAD 患者有重要的预后价值：用 Kaplan-Meier 生存分析、单因素和多因素 Cox 回归分析发现，DKK1 表达高的 LUAD 患者预后差，它也是影响患者总生存期的独立预后因素，有潜力成为独立的预后生物标志物。
综合这些研究结果，研究人员发现 PRKG1-AS1 在 LUAD 组织和细胞里明显上调，和患者的不良预后有关，还和 TNM 分期、N 分期显著相关。功能富集分析表明它参与了多种肿瘤相关的生物过程和信号通路，主要定位在细胞核，敲低它能抑制 LUAD 细胞的增殖和迁移。而且，PRKG1-AS1 和癌基因 DKK1 共表达，敲低 PRKG1-AS1 会让 DKK1 表达下降，DKK1 在 LUAD 组织里也过表达，和患者的不良预后有关。
这项研究意义重大。它让我们对 LUAD 的发病机制有了新的认识，找到了 PRKG1-AS1 和 DKK1 这两个和 LUAD 密切相关的分子，为以后开发针对 LUAD 的诊断方法、治疗策略提供了新的方向。也许在不久的将来，医生们就能根据这些研究成果，更好地治疗 LUAD 患者，提高他们的生存率和生活质量。
