编辑推荐：
为解决临界尺寸骨缺损治疗难题，研究人员开展 3D 打印基因激活磷酸钙水泥（CPC）支架用于骨再生的研究。结果显示该支架可转染多种细胞，但基因表达水平低。此研究为骨再生探索新方向，值得科研读者一读。
在医学领域，骨头受伤后的修复一直是个备受关注的话题。大家都知道，骨头有着一定的自我修复能力，可要是受伤的面积太大，它就 “心有余而力不足” 了。那些即使做了手术也无法自行愈合的骨头损伤，被称为 “临界尺寸缺损” （critical-sized defects），这可给医生们出了个大难题。像因为感染得进行骨头清创、骨头肿瘤切除、先天性畸形，还有高能量创伤和爆炸伤等情况，都可能导致这种棘手的缺损出现。
目前，针对这种缺损的治疗方法主要有自体移植、异体移植，或者植入替代材料来促进骨头再生。但这些方法都有各自的 “小毛病”。自体移植虽然效果不错，可能用的自体骨头数量有限；非再生性的植入材料用久了容易出问题；异体移植呢，还存在疾病传播的风险。还有一种叫 Masquelet 的技术，需要患者接受两次手术，先在缺损处填充一个间隔物，诱导形成一层膜，6 - 8 周后再换成骨移植材料。虽说这种技术有一定成效，可两次手术不仅让患者多遭罪，治疗费用也跟着增加了。
在这样的背景下，科研人员们开始另辟蹊径，寻找更理想的治疗方案。于是，3D 打印技术进入了他们的视野。3D 打印能够精确控制材料的成分和形态，打印出的支架可以拥有合适的表面纹理、相互连通的孔隙网络，孔隙大小也能精准调控，这些特点都有助于骨头的再生。而且，它还能根据患者的具体情况，定制出完美贴合的支架，在颅面重建和整形外科手术中大展身手。此前有研究发现，3D 打印的磷酸钙（calcium phosphate，简称 CP）植入物，再加上骨形态发生蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP - 2），有可能替代 Masquelet 技术，成为一种更简便的治疗方法。不过，BMP - 2 虽然能促进骨头愈合，但直接把它加载到支架上进行局部给药，问题也不少。为了维持有效浓度，就得用大量的 BMP - 2，这使得治疗费用飙升，还可能引发异位骨化等副作用。
为了解决这些问题，美国的研究人员另寻他法。他们在《Journal of Pharmaceutical Sciences》期刊上发表了一篇名为《3D Printed Gene - Activated Calcium Phosphate Cement Scaffolds for Bone Regeneration》的论文。研究发现，3D 打印、表面修饰且基因激活的 CP 支架虽然能够成功转染多种细胞，但打印晶格的基因表达水平很低，目前还不太可能在体内促进骨形成。不过，基因激活支架有望避免使用 BMP - 2 蛋白带来的高成本和异位骨化等问题，未来只要想办法提高 3D 打印 CP 晶格的转染效率，它或许能成为一种极具潜力的治疗方法。
为了开展这项研究，研究人员运用了多个关键技术方法。他们使用 3D 打印技术制作 CP 支架，通过改变打印压力、速度等参数，打印出不同结构的支架。还用扫描电子显微镜观察支架表面的微观结构，分析表面纹理和形态。通过压缩测试，来测定支架的抗压强度和杨氏模量，了解其机械性能。另外，采用特定的细胞培养技术，将细胞接种到支架上，研究细胞的生长和分化情况。
下面咱们来看看具体的研究结果。
- CP 打印件的表面分析：研究人员用扫描电子显微镜观察不同硬化方法处理后的 CP 打印件。结果发现，“水单独法”（water alone method，WA）会让 CP 晶格的支柱出现裂缝，而 “蒸汽单独法”（vapor alone method，VA）、“蒸汽 + 水法”（vapor + water，VW）和 “蒸汽 + 模拟体液法”（vapor + simulated body fluid，VS）则不会。从表面纹理来看，VA 法处理的表面纹理最少，WA、VW 和 VS 法处理的表面纹理更多。通过比表面积分析也证实，WA 组的比表面积最大，VA 组最小，VW 和 VS 组介于两者之间。
- CP 打印件的机械测试：对 CP 打印件进行机械压缩测试后发现，抗压强度和杨氏模量的均值呈现出 WA < VA < VW < VS 的规律。只有 VS 打印件在这两个指标上与 WA 和 VA 打印件有显著差异，这说明 VS 法处理的打印件机械性能更好，更能承受外界的压力。
- CP 打印件对细胞培养基的影响：把 CP 打印件浸泡在 DMEM 培养基中 24 小时后检测发现，所有打印件都会让培养基中的钙浓度降低到新鲜 DMEM 的 50% 以下，同时提高培养基的 pH 值。不同硬化方法对钙浓度降低和 pH 值升高的影响程度不同，VA 打印件使钙浓度下降最多，pH 值升高也最大；WA、VW 和 VS 法处理的打印件钙含量相当，WA 和 VW 组的 pH 值比 VS 组低。
- 硬化方法对 BMSC 分化的影响：将骨髓间充质干细胞（bone marrow - derived mesenchymal stem cells，BMSCs）接种到 CP 打印件上培养 7 天后检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。结果显示，ALP 活性的变化规律和机械测试结果一致，也是 WA < VA < VW < VS。虽然 VW 和 VS 组之间差异不显著，但 VS 组的平均 ALP 活性更高，这表明 VS 法可能更有利于促进 BMSCs 的分化。
- 不同硬化方法处理的 CP 圆盘转染效率的表征：用通过冻干涂层法用多聚体（编码增强型绿色荧光蛋白 EGFP）对不同硬化方法处理的 CP 圆盘进行基因激活，再接种 HEK 293T 细胞。3 天后通过流式细胞术检测发现，VW 和 VS 法的平均转染效率最高，但这两种方法的转染效率也存在很大的变异性。
- CP 晶格的基因表达表征：用 VS 法硬化的 CP 晶格，通过冻干涂层法用多聚体（编码 EGFP 或荧光素酶）进行基因激活，然后分别接种 HEK293T 细胞或 MC3T3 细胞。结果显示，两种细胞都能被转染，但转染效率都比较低。在基因表达方面，从第 2 天到第 8 天，两种细胞都能检测到荧光素酶表达，但表达水平较低，尤其是 HEK 293T 细胞的阳性对照组，其荧光素酶表达远高于基因激活的 CP 晶格。
- 多聚体吸附到 CP 颗粒后的转染情况：将多聚体溶液与 CP 颗粒混合离心后，用不同处理的溶液转染 HEK 293T 细胞。结果发现，离心后的上清液无法转染细胞，而 CP 颗粒和多聚体的混合物离心后的沉淀虽能使细胞发生转染，但效率极低。未经离心的多聚体溶液和离心后的多聚体溶液上清液转染效率相同。
综合研究结果和讨论部分来看，这项研究意义重大。研究人员成功制备出了 3D 打印、表面修饰且基因激活的 CP 支架，并且证实它能成功转染多种细胞，这为骨再生治疗开辟了新的方向。虽然目前基因激活的 CP 晶格基因表达水平较低，还不能有效促进体内骨形成，但研究人员已经找到了问题所在，比如多聚体容易吸附到 CP 表面，影响转染效率。这为后续的研究指明了方向，未来可以通过改变打印件的表面性质，减少多聚体的吸附，或者换用其他不易吸附的基因传递系统，来提高转染效率。一旦这些问题得到解决，基因激活支架有望成为一种更安全、有效的骨再生治疗方法，为那些饱受骨头缺损困扰的患者带来新的希望。
