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为解决 3-HP 生产中浓度、产率和生产力未达商业标准的问题，相关研究人员开展优化毕赤酵母生产 3-HP 的研究。结果显示乳酸转运蛋白可提升 3-HP 产量等。该研究为 3-HP 工业化生产提供思路，值得科研人员一读。
在如今这个追求可持续发展的时代，全球变暖问题日益严峻，对化石燃料的过度依赖也带来了诸多隐患。有没有一种神奇的方法，既能缓解全球变暖，又能减少对化石燃料的依赖呢？科学家们把目光投向了二氧化碳转化的甲醇。甲醇可以作为一种可持续的碳和能源来源，如果能将它生物转化为有价值的化学品，那可就太棒啦！
3 - 羟基丙酸（3 - HP）就是这样一种极具潜力的化学品。它可是个 “万能小能手”，能作为前体生产多种有价值的化学品，像丙稀酸酯、1,3 - 丙二醇等。而且，它还能在合成先进材料领域大展身手，替代那些基于石化产品的聚合物呢！美国能源部都对它青睐有加，两次将它列为重要的生物基增值化学品。
不过，3 - HP 的生产目前还面临着不少挑战。化学合成 3 - HP 的方法不太理想，原材料成本高、产量低、反应步骤复杂，还会涉及有毒有害的化合物。而利用微生物来生产 3 - HP 呢，虽然有不少微生物能合成它，但又存在副产物多、产量和生产效率不理想的问题。
在众多微生物中，酵母脱颖而出，成为了生产 3 - HP 的热门选手。酵母能在低 pH 环境下生存，这可太有优势啦！在这种环境下，3 - HP 大多以未离解的形式存在，下游处理成本也会降低。其中，甲基营养型酵母毕赤酵母（Komagataella phaffii，也叫巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris ）更是备受关注，它能以甲醇为唯一碳源和能源生长，是生产高附加值化学品的潜力股。之前，研究人员已经成功让毕赤酵母生产 3 - HP 了，可产量和生产效率还是没达到商业化的标准。
为了攻克这些难题，研究人员们不断探索。作者[第一作者单位] 的研究人员在《Microbial Cell Factories》期刊上发表了题为 “Engineering metabolic precursors supply and 3-hydroxypropionic acid export in Komagataella phaffii for improved production from methanol” 的论文。他们通过一系列代谢工程策略，对之前开发的 3 - HP 生产菌株进行优化，最终得出结论：乳酸转运蛋白（如 Esbp6 和 Jen1）能有效促进毕赤酵母中 3 - HP 的输出，即便在较低 pH 条件下，也能提高 3 - HP 的产量、产率和生产效率。这一研究成果为 3 - HP 的工业化生产带来了新的希望。
研究人员为了开展这项研究，用到了几个关键的技术方法。首先是 CRISPR/Cas9 技术，利用它对毕赤酵母进行基因编辑，实现基因的敲除和整合。然后通过高效液相色谱（HPLC）技术来准确地量化甲醇和 3 - HP 的含量。还有通量平衡分析（FBA）这种计算方法，借助它来计算理论上 3 - HP 的最大产量，从多方面对实验进行分析和研究。
下面我们来看看具体的研究结果。
工程化 β - 丙氨酸途径的前体供应以生产 3 - HP
为了让丙酮酸更多地转化为 β - 丙氨酸途径的前体天冬氨酸，研究人员对相关基因进行了操作。他们分别过表达了编码丙酮酸羧化酶同工型 2（PYC2 ）和胞质天冬氨酸转氨酶 2（AAT2 ）的基因。PYC2 就像一个勤劳的 “小工匠”，能催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸（OAA）；AAT2 则负责把 OAA 转化成天冬氨酸。他们还测试了一种来自粘质沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）的天冬氨酸脱氢酶（SpeAspDH），看看它能不能替代毕赤酵母自身的 AAT2。
研究人员把这些基因分别导入原始菌株 PpCβ21 中，在 24 孔深孔板中培养 48 小时后发现，除了过表达 PYC2 的菌株 PpCβ21 - Y，其他单独过表达基因的菌株，最终的 3 - HP 浓度和甲醇产率都没有显著提高。PpCβ21 - Y 菌株的 3 - HP 生物量产率倒是有轻微但显著的增加，不过研究人员猜测，这可能是因为 ATP 供应不足，或者碳酸氢盐成了限制因素。
后来，研究人员又尝试共表达 PYC2 和 AAT2，还过表达了来自假单胞菌（Pseudomonas） sp. 101 的突变型 NADP 依赖型甲酸脱氢酶 PseFDH (V9)，想增强 NADPH 的供应。但这些尝试在 24 孔深孔板培养实验中效果都不太理想，不过基于之前 PseFDH (V9) 在生物反应器规模培养中的表现，研究人员还是把含有它的菌株 PpCβ21 - P 作为进一步代谢工程改造的基础菌株。
过表达单羧酸转运蛋白编码基因可提高 3 - HP 产量
当 β - 丙氨酸途径相关基因过表达，3 - HP 在细胞内积累时，会带来一些问题。因为细胞质接近中性 pH，3 - HP 会解离，释放出的质子和阴离子很难扩散到细胞外，高浓度的 3 - HP 会影响细胞代谢。
为了解决这个问题，研究人员把编码假定单羧酸转运蛋白的 JEN1 和 ESBP6 基因，分别导入 PpCβ21 - P 菌株中。在 24 孔深孔板的 BMM 培养基中培养 48 小时后，过表达 ESBP6 的菌株 PpCβ21 - PE 产生的 3 - HP 浓度最高，产量和产率相比参考菌株都提高了 44% 。而过表达 JEN1 的菌株 PpCβ21 - PJ，3 - HP 产量和产率的提升就比较有限，这说明 Jen1 转运 3 - HP 的效率可能比 Esbp6 低。
研究人员还同时过表达了 JEN1 和 ESBP6，得到菌株 PpCβ21 - PEJ，它的 3 - HP 产量和产率也有一定提升。最后，他们把 PYC2 基因整合到 PpCβ21 - PEJ 基因组中，得到菌株 PpCβ21 - PEJY，但这个菌株在 24 孔深孔板培养时，3 - HP 产量和产率与 PpCβ21 - PEJ 相比没有显著变化。不过，PpCβ21 - PEJ 和 PpCβ21 - PEJY 这两个菌株，相比参考菌株 PpCβ21 - P，在产量和产率上的提升还是很明显的，所以被选出来进行下一步生物反应器实验。
补料分批培养中 3 - HP 的生产
研究人员在生物反应器中对 PpCβ21 - PEJ 和 PpCβ21 - PEJY 这两个菌株进行补料分批培养。培养过程分三个阶段：先是甘油分批培养阶段积累生物量；然后是过渡阶段，用甲醇脉冲和恒定甲醇进料让细胞适应甲醇环境；最后是甲醇进料阶段，用预编程的指数甲醇进料策略生产 3 - HP。
在这个过程中，两个菌株表现相似，最终 3 - HP 浓度都达到了 24.6g/L 。研究人员又对 PpCβ21 - PEJY 菌株进行了一次实验，调整了甲醇进料阶段的生长速率。这次实验中，3 - HP 浓度从 5g/L 增加到了 27.0 ± 0.4g/L，相比亲本菌株 PpCβ21 - P 提升了 42% 。而且，PpCβ21 - PEJY 菌株的二氧化碳产率降低了，3 - HP 产率和生物量产率都提高了，体积生产力也提升了 20% 以上。这进一步证明了乳酸转运蛋白能有效促进 3 - HP 的输出。
ESBP6 和 JEN1 过表达提高了菌株在 pH 3.5 条件下的稳健性
在低 pH 条件下生产 3 - HP 好处多多，能降低下游处理成本，减少细菌污染风险。研究人员就测试了参考菌株 PpCβ21 - P 和工程菌株 PpCβ21 - PEJY 在 pH 3.5 的补料分批培养中的表现。
结果发现，两个菌株在酸性 pH 下都能生产 3 - HP，但 PpCβ21 - PEJY 的表现更出色。虽然两个菌株在 pH 3.5 时的 3 - HP 产率都比 pH 5 时低，但 PpCβ21 - PEJY 的产率下降幅度更小。这是因为在酸性条件下，3 - HP 大多以未离解的形式存在，进入细胞后会解离，释放出的质子和阴离子会给细胞带来压力。而 PpCβ21 - PEJY 中过表达的单羧酸转运蛋白，尤其是 ESBP6，能有效促进阴离子 3 - HP 的输出，所以受低 pH 的影响更小。而且，两个菌株在不同 pH 下的生物量浓度相当，这说明酸性 pH 对生物量产率没有影响。
敲除内源性 NAD 依赖型甲酸脱氢酶编码基因（FDH1）揭示了异源 NADP 依赖型甲酸脱氢酶的效率有限
甲醇异化途径虽然能解毒甲醛和产生能量，但会释放大量二氧化碳，造成碳损失。研究人员想通过敲除编码 NAD 依赖型甲酸脱氢酶的 FDH1 基因，减少二氧化碳的生成，让甲酸氧化只通过 NADP 依赖型的 PseFDH (V9) 进行。
他们敲除了 PpCβ21 - PEJ 和 PpCβ21 - PEJY 菌株中的 FDH1 基因，得到 PpCβ21 - PEJΔfdh1 和 PpCβ21 - PEJYΔfdh1 菌株。在 24 孔深孔板培养实验中，这两个敲除菌株的 3 - HP 产量和细胞生长都大幅下降，还积累了甲酸和甲醇。这表明敲除 FDH1 后，细胞能量失衡，PseFDH (V9) 的活性不足以完全氧化甲酸，还可能是因为有毒中间产物的积累影响了细胞生长。
综合这项研究的结论和讨论部分来看，研究人员通过多种代谢工程策略，成功提高了毕赤酵母生产 3 - HP 的性能。首次在毕赤酵母中表达酿酒酵母（S. cerevisiae）的乳酸转运蛋白 Esbp6 基因，证实了它能有效促进 3 - HP 的输出。不过，敲除 FDH1 基因会损害细胞生长，这可能是因为能量失衡或者异源 PseFDH (V9) 性能不佳。
这项研究的意义重大，它不仅证明了乳酸转运蛋白在促进 3 - HP 输出方面的作用，还在工业相关的低 pH 培养条件下进行了 3 - HP 生产的测试。不过，要实现 3 - HP 的工业化生产，还有很长的路要走。未来需要进一步提高甲醇同化效率，对代谢网络进行全面分析，探索能量和氧化还原代谢的最优方式，同时考虑途径分区等问题。但无论如何，这项研究为毕赤酵母成为生产 3 - HP 的工业细胞工厂奠定了基础，也为微生物细胞工厂生产工业羧酸指明了方向。
