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为解决 PROTACs 快速筛选难题，研究人员开展基于双报告基因系统筛选 PROTACs 的研究。结果构建出该系统并筛选出 SIRT2-PROTACs。这加速了 PROTAC 药物研发，推荐科研读者阅读，了解该前沿技术应用。
在如今的药物研发领域，有一种新兴且强大的技术 —— 蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）。它就像是药物研发世界里的 “神奇工匠”，能够利用细胞内的泛素 - 蛋白酶体系统（UPS），把那些难以对付的目标蛋白降解掉，从而达到治疗疾病的目的。想象一下，细胞里那些 “调皮捣蛋”、引发疾病的蛋白，被 PROTAC 精准定位，然后 “拆解” 掉，这是多么神奇的过程。
目前，已经有一些 PROTAC 药物进入了临床试验阶段，比如 ARV110 和 ARV471，它们分别在前列腺癌和乳腺癌的治疗上展现出了潜力。但是，研发 PROTAC 药物的道路并非一帆风顺。在评估 PROTAC 的效果时，需要准确地知道目标蛋白的降解情况。现在常用的方法，像蛋白质免疫印迹法（WB）和质谱法，虽然能够检测蛋白水平的变化，可它们有不少缺点。WB 操作起来步骤繁琐，需要多个实验环节，特别耗费时间，而且它对高质量、特异性抗体的依赖程度很高，如果没有合适的抗体，就很难准确地对蛋白进行定量分析。质谱法虽然定量很准确，但是设备昂贵，还需要专业的操作人员，这就限制了它的广泛使用。还有一种 Lumit 免疫分析技术，虽然简单快速又灵敏，可它也面临着化学标记复杂、标签兼容性差、空间位阻、组装效率低以及成本高等问题，并且无法检测亲和力低于特定阈值的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
面对这些挑战，作者[第一作者单位] 的研究人员决心寻找新的方法。他们在《期刊原文名称》上发表了一篇名为《论文原文标题》的论文。经过一系列研究，他们成功构建了一种双报告基因系统，这个系统就像是一个高效的 “筛选小助手”，可以快速地筛选 PROTACs，还发现了针对 SIRT2（一种在细胞生理过程中有着重要作用的蛋白，与神经系统疾病和癌症等多种疾病相关）的有效候选 PROTACs。这一成果意义重大，为 PROTAC 药物的研发按下了 “加速键”，让未来攻克更多疾病有了新的希望。
为了完成这项研究，研究人员主要用到了以下几个关键技术方法：首先是构建稳定细胞系，通过将带有目标基因的双报告基因质粒、包装质粒和包膜质粒转染到细胞中，获得稳定表达目标蛋白融合荧光素酶的细胞系；其次是利用蛋白质免疫印迹法（WB）来检测蛋白的表达和降解情况；还有借助多功能酶标仪进行生物发光成像，通过检测荧光和生物发光信号来分析蛋白水平变化；最后采用蛋白质组学分析方法，对细胞内的蛋白质进行定量研究 。
下面我们来详细看看他们的研究结果。
荧光和化学发光报告系统的构建
研究人员推测 PROTACs 能够降解由目标蛋白和海肾荧光素酶（RLUC）形成的融合蛋白，而且可以通过 RLUC 催化腔肠素产生的发光强度来判断降解效率。就好比给目标蛋白装上了一个 “发光小尾巴”，通过观察 “尾巴” 的发光情况就能知道目标蛋白有没有被降解。
他们以雄激素受体（AR）为目标蛋白构建双报告系统，把增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为内参，这样就能避免因为细胞增殖带来的误差。AR 基因有四个结构域，其中 LBD 区域（tAR）能和药物结合，研究人员把 tAR 插入到 RLUC 下游，构建出 RLUC - tAR 融合蛋白。
他们把表达 EGFP 和 RLUC - tAR 的慢病毒载体转染到 HEK293T 细胞后，经过筛选和分选，得到了 EGFP 阳性率约 98% 的细胞，并且这些细胞成功表达了 RLUC - tAR 融合蛋白。进一步研究发现，随着细胞数量增加，细胞发光逐渐增强，而且 EGFP 能同步反映细胞数量变化，可以作为光学检测的内参蛋白。
利用双报告系统检测 ARV110 的降解功能
接下来，研究人员想看看 AR PROTAC（ARV110）能不能降解细胞内的 RLUC - tAR。他们在细胞中加入不同浓度的 ARV110、恩杂鲁胺（ENZA）或泊马度胺（POM），培养 8 小时后进行终点分析。结果发现，随着 ARV110 剂量增加，RLUC 发光逐渐减弱，在 50 - 400 nM 时达到最低，而 EGFP 信号没有明显变化。经过 WB 分析验证，发现 RLUC - tAR 蛋白确实随着 ARV110 浓度增加而逐渐降解。
为了排除 ARV110 与 RLUC 非特异性结合的可能，他们用转染了 EG 和裸 FPRLUC 蛋白的细胞进行实验，结果发现 ARV110 处理后，这种细胞的 RLUC 发光没有明显变化。而且，他们还通过实验证实了 UPS 在 ARV110 诱导的降解中发挥作用，并且用终点法绘制了时间曲线，观察到 ARV110 处理后，目标蛋白在 8 小时左右降解到最低，之后有一定程度的恢复。最后，在前列腺癌细胞（LNCaP）中也验证了 ARV110 能剂量依赖性地降解野生型全长 AR，和双报告系统的结果一致。这一系列实验表明，双报告系统能够快速准确地反映融合蛋白的降解变化。
利用双报告系统筛选 SIRT2 的理想 PROTACs
既然双报告系统能成功检测 RLUC - tAR 的降解，研究人员就想用它来筛选针对其他蛋白的 PROTACs，比如 SIRT2。SIRT2 是 sirtuin 家族中的一员，在细胞中起着重要作用，和癌症的关系也很密切，是一个很有潜力的药物靶点。
研究人员设计合成了一系列基于 TM 的 SIRT2 降解剂，这些降解剂和已有的 SIRT2 PROTAC（TM - P4 - Thal）在连接位点等方面有所不同。他们原本想用 HEK293T 细胞进行筛选，但是发现 HEK293T 细胞内源性 SIRT2 表达量很高，会干扰筛选结果，于是选择了低表达 SIRT2 的肺癌细胞系 A549。
在 A549 细胞中用双报告系统筛选后，发现化合物 121、128 和 129 在 0.1 μM 时降解效果最好，不过在高浓度时，有些化合物出现了蛋白水平恢复的情况，可能是因为 PROTAC 的钩状效应。经过免疫印迹验证，这三种化合物确实有 SIRT2 降解能力。在 MCF - 7 细胞中进一步验证，发现化合物 128 和 129 能剂量依赖性地降解 SIRT2，而且对 SIRT1 和 SIRT3 没有降解作用，特异性很好。同时，通过实验证实了 SIRT2 降解是通过 UPS 途径，还进行了蛋白质组学研究，发现化合物 128 对 SIRT2 有显著降解作用，对其他 SIRT 家族成员没有明显影响。
SIRT2 PROTACs 抑制去乙酰化并提高细胞毒性
研究人员还评估了筛选出的 PROTACs 对 SIRT2 去乙酰化的抑制作用。他们用不同浓度的 PROTACs 处理 MCF - 7 细胞 6 小时后，通过免疫印迹检测 α - 微管蛋白的乙酰化水平。结果发现，化合物 128 和 129 在 0.01 - 10 μM 浓度范围内，能显著增加 α - 微管蛋白的乙酰化水平，而且这种抑制作用比相同浓度的 TM 更强。
在评估对 MCF - 7 细胞增殖的影响时，发现 PROTACs 比 TM 具有更强的细胞毒性，化合物 128 在高浓度时的杀伤活性比化合物 129 略强，可能是因为它的钩状效应更弱。这一系列结果表明，化合物 128 和 129 是很有潜力的 SIRT2 PROTAC 候选化合物。
从研究结论和讨论部分来看，虽然目前已经有很多 PROTACs 在研发，但高通量筛选初始化合物仍然是个难题。双报告系统在这次研究中展现出了很大的优势，它能用于高通量筛选，而且操作相对简单。不过，它也存在一些不足，比如外源性融合蛋白的标签可能会影响目标蛋白的构象，实验中使用的底物化学稳定性较差，只能采用终点法检测，不能实时监测。但是，研究人员通过实验证明了双报告系统在筛选 PROTACs 方面的有效性，还筛选出了有潜力的 SIRT2 PROTACs，为后续的药物研发提供了重要的基础。未来，研究人员可以针对这些不足进行改进，进一步优化双报告系统，同时对筛选出的 PROTACs 进行结构优化和细胞功能测试，有望开发出更有效的药物，为人类健康带来更多的福祉。
