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为探究 TIS 细胞中 Ca2?通量及 MERCS 的变化机制，研究人员开展相关研究。结果发现 TIS 细胞 MERCS 增加但 Ca2?通量减少，抑制该通量有 senolytic 效果。推荐阅读，助你了解衰老细胞研究新进展。
在细胞的微观世界里，有一种特殊的现象 —— 细胞衰老（Cellular senescence），它就像是细胞生命旅程中的一个特殊阶段。正常的细胞就像充满活力的小战士，能够不断地生长、分裂，为身体的正常运转贡献力量。但当细胞进入衰老阶段，就像是战士们累了，它们不再像以前那样积极地复制自己，而是停下脚步，并且整个 “状态” 都发生了变化。
细胞衰老时，会出现很多特征性的改变。比如，它们的分泌物质（secretome）变了，一些肿瘤抑制基因被激活，染色质和基因组的完整性也受到影响，就连细胞内的 “能量工厂” 线粒体也出现各种问题，像线粒体网络失衡、膜电位和电子传递链发生变化等等。而且，细胞衰老还分好几种类型呢，像复制性衰老（replicative senescence）、癌基因诱导的衰老（oncogene-induced senescence，OIS），还有咱们今天重点要说的治疗诱导的衰老（therapy-induced senescence，TIS）。
在细胞的各种生理活动中，线粒体的功能至关重要，而钙离子（Ca2?）进入线粒体这个过程，就像是给线粒体 “充电” 的关键步骤。Ca2?主要是从内质网（endoplasmic reticulum，ER）经过一些特殊的通道进入线粒体的。这些通道位于线粒体和内质网挨得很近的地方，它们形成了一种类似突触的结构，叫做线粒体 - 内质网接触位点（mitochondria-ER contact sites，MERCS） ，厚度大概在 10 到 50 纳米之间。内质网里的 Ca2?在一些受体，比如肌醇 1,4,5 - 三磷酸受体（inositol 1,4,5-trisphosphate receptors，InsP?Rs）和兰尼碱受体（Ryanodine Receptors，RyR）的帮助下释放出来，然后穿过线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道（Voltage Dependent Anion Channel，VDAC） ，再到达线粒体内膜上的线粒体 Ca2?单向转运体复合物（mitochondrial Ca2? uniporter complex，MCUC），这样就能进入线粒体啦。
之前有研究发现，在一些特定类型的衰老细胞中，MERCS 会增多，ER 和线粒体之间的 Ca2?通量也会增加。可是，对于化疗诱导的衰老细胞，也就是 TIS 细胞来说，这里面的情况还不太清楚。要知道，很多癌症患者在接受化疗后，虽然肿瘤可能得到了控制，但却会出现加速衰老和身体虚弱的情况，这和体内的衰老细胞有很大关系。所以，要是能搞清楚 TIS 细胞里 Ca2?通量的秘密，说不定就能找到新的治疗方法，帮助这些患者，这也是研究人员开展这项研究的重要原因。
为了揭开这个谜团，研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了一篇名为 “Therapy-induced senescence reduces endoplasmic reticulum–mitochondria calcium flux that can be targeted for senolysis” 的论文。通过一系列研究，他们发现 TIS 细胞里 MERCS 的接触面积增加了，但是 ER 和线粒体之间的 Ca2?通量却明显减少了。而且，抑制这种 Ca2?通量在体外和体内都能起到清除衰老细胞的作用，这就为治疗和衰老相关的疾病提供了新的思路和方法。
研究人员在开展研究的时候，用到了几个很关键的技术方法。他们用共聚焦显微镜（confocal microscopy）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）来观察细胞内的结构，看看 ER 和线粒体的距离以及 MERCS 的覆盖比例有什么变化。还通过一些荧光探针，比如 Fluo - 4/AM、Rhod - 2AM 和 MitoGCamp5，来检测细胞质和线粒体里 Ca2?的信号变化。另外，蛋白质免疫印迹（western blotting）技术帮他们分析相关蛋白的表达水平，而邻近连接分析（Proximity Ligation Assay，PLA）则让他们了解蛋白之间的相互作用情况。
下面咱们来详细看看研究结果。
- TIS 细胞模型的建立与特征：研究人员选了人类二倍体 IMR - 90 成纤维细胞来做实验，用两种化疗药物阿霉素（Doxorubicin，Doxo）和依托泊苷（Etoposide，Eto）处理这些细胞 48 小时，然后在处理后的第十天把细胞收集起来做各种实验。经过检测发现，这些细胞的增殖被抑制了，细胞周期的负调节因子 p16 和 p21 的表达增加了。而且，衰老相关 β - 半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）阳性的细胞变多了，衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）里的一些成分，像 IL6、IL1α、IL1β、CXCL1 和 MMP3 的含量也都上升了。这就说明，他们成功建立了 TIS 细胞模型。
- TIS 细胞中 MERCS 和 Ca2?通量的变化：研究人员先用共聚焦显微镜观察，发现 TIS 细胞中 ER 和线粒体的距离变近了，MERCS 的覆盖比例增加了。不过，为了更准确地测量，他们又用了透射电子显微镜。结果和共聚焦显微镜观察的差不多，TIS 细胞里 MERCS 的覆盖比例确实增加了，但是 ER 和线粒体之间的距离也有一点点变大。在检测 Ca2?通量的时候，研究人员用了两种方法，Rhod - 2AM 和 MitoGCamp5。结果发现，用组胺刺激后，TIS 细胞的线粒体 Ca2?摄取减少了。而且，TIS 细胞中 IP?R 介导的 Ca2?从内质网的释放也减少了。这就表明，虽然 TIS 细胞里 MERCS 变多了，但是 Ca2?通量却下降了。
- Ca2?通量减少的机制：为了弄清楚为什么 Ca2?通量会减少，研究人员对 MERCS 里的一些蛋白进行了研究。他们发现，和正常生长的细胞相比，TIS 细胞里三种 IP?R 亚型的表达都有明显下降的趋势，但是其他一些蛋白，像 GRP75、VDAC、MCU、MICU1、PDI 和 TOMM20 的表达并没有明显变化。通过邻近连接分析（PLA），他们还发现，在 TIS 细胞里，IP?R1 和 VDAC 之间的距离变远了，但是 IP?R2 和 VDAC、内质网驻留蛋白 PDI 和 VDAC 之间的距离却变近了。综合这些结果，说明 TIS 细胞里 ER 和线粒体之间的结构相互作用增加了，但是这种相互作用把 IP?R1 排除在外，所以导致了 Ca2?通量的减少。
- 抑制 ER - 线粒体 Ca2?通量对 TIS 细胞的影响：研究人员知道 Ca2?通量对细胞的生存很重要，所以他们想看看抑制 TIS 细胞里的 Ca2?通量会有什么效果。他们用了一种叫去甲基 XeB（desmethyl XeB，dmXeB）的 IP?R 抑制剂来处理细胞。结果发现，dmXeB 对正常生长的细胞活力没什么影响，但是对 TIS 细胞的活力影响很大，和一种很有名的衰老细胞清除剂 ABT - 263 的效果差不多。而且，用一些抑制剂，比如坏死性凋亡抑制剂 Nec - 1 和半胱天冬酶泛抑制剂 ZVAD，还能部分逆转 dmXeB 引起的 TIS 细胞死亡。在动物实验中，研究人员用 20 个月大的 p16 - 3MR 转基因小鼠做实验，先给小鼠用阿霉素诱导 TIS，然后再用 dmXeB 或者更昔洛韦（ganciclovir，GCV）处理。结果发现，用 dmXeB 处理后，小鼠肝脏里衰老标记物 p16 的荧光强度明显下降，皮下脂肪里 SA - β - Galactosidase 染色也显著减少。这就说明，减少 ER 和线粒体之间的 Ca2?通量可以作为 TIS 细胞衰老清除的一个靶点，dmXeB 是一种很有潜力的衰老细胞清除剂。
最后，咱们来总结一下研究结论和讨论部分。这项研究发现，TIS 细胞有两个很重要的变化，MERCS 增加了，但是线粒体 Ca2?通量却减少了，这两个变化对维持 TIS 细胞的稳态都很关键。ER 和线粒体之间受损的 Ca2?转移是 TIS 细胞的一个 “弱点”，可以作为清除衰老细胞的一个很有吸引力的靶点。而 dmXeB 这种物质，在研究中展现出了清除衰老细胞的能力，有潜在的治疗应用价值。
不过，研究也有一些局限性。目前的研究只在 IMR - 90 细胞上进行，还需要在其他间充质和上皮细胞类型中进一步验证。而且，研究用的是拓扑异构酶抑制剂来诱导衰老，还不知道其他类型的化疗药物会不会有类似的结果。但是，这些局限性并不影响这项研究的重要意义。癌症幸存者的加速衰老和虚弱问题一直困扰着大家，这项研究为发现和开发新的衰老细胞清除治疗方法提供了方向。虽然还需要更多实验来验证 dmXeB 在体内的效果，包括评估它的长期毒性，但是目前短期治疗的结果已经很让人期待了。相信在未来，随着研究的不断深入，这些发现会为改善患者的生活质量带来新的希望，帮助人们更好地应对和衰老相关的各种问题。
