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为解决器官型培养质量控制难题，研究人员开展角质形成细胞分化与代谢研究。他们发现 MPM-FLIM 可监测其分化，且分化伴随代谢转变。该成果为皮肤研究及细胞培养质量控制提供新方法，值得科研人员一读。
在生物医学研究领域，器官型细胞培养（模拟体内组织细胞的生长环境，在体外构建的细胞培养模型）的发展可谓是一场革命。它就像一个神奇的 “小世界”，为研究细胞行为、生理过程、疾病机制以及药物研发和再生医学应用提供了极为宝贵的平台。尤其是在皮肤研究方面，科研人员一直致力于打造更逼真的皮肤模型，甚至已经有了包含毛囊的 3D 生物打印皮肤模型。
不过，这个 “小世界” 想要完美复制真实组织的特征，还面临着不小的挑战。传统的质量控制方法，比如生化和免疫组化手段，就像是 “大麻烦”。它们不仅耗费时间，而且在检测过程中会破坏样本，这就好比为了检查一个精美的艺术品内部构造，却把它给打碎了，显然不是理想的办法。所以，科学家们迫切需要一种高效、可靠的非侵入性方法（不会对样本造成物理性破坏的方法），能在不打扰样本的情况下，准确评估细胞培养的发育状态。
在这样的背景下，作者[第一作者单位] 的研究人员踏上了探索之旅。他们在《< 期刊原文名称 >》上发表了题为《< 论文原文标题 >》的论文。经过一系列的研究，他们发现多光子显微镜结合荧光寿命成像（MPM-FLIM）技术就像一把神奇的 “钥匙”，可以用来监测角质形成细胞（构成表皮的主要细胞类型）的分化过程。这一发现意义重大，为器官型细胞培养的质量控制提供了新的方向，就像是在黑暗中点亮了一盏明灯。
为了开展这项研究，研究人员运用了多个关键技术方法。他们借助 qPCR（定量聚合酶链式反应，可用于检测基因表达量）、免疫印迹（通过蛋白质电泳和抗体结合，检测特定蛋白质的存在和含量）和免疫荧光（利用荧光标记的抗体，在显微镜下观察细胞内特定蛋白的分布）技术，来研究细胞分化情况。使用 Seahorse XFe96 Flux Analyzer 进行代谢通量分析（检测细胞代谢过程中氧气消耗和酸性物质产生的变化，从而了解细胞代谢途径的改变），探究细胞代谢的变化。还利用 MPM-FLIM 技术对细胞进行代谢成像，获取细胞代谢状态的相关信息。
下面我们来详细看看研究结果。
高钙处理诱导角质形成细胞分化
研究人员就像一群 “细胞调控师”，为了确认高 Ca2?处理能否让角质形成细胞发生分化，进行了一系列有趣的实验。他们将新生儿人类表皮角质形成细胞（HEKn）分别放在低（60 μM）和高（1.5 mM）Ca2?浓度的环境中培养，就像给细胞安排了不同的 “生活环境”。同时，他们还评估了维生素 C 和角质形成细胞生长因子（KGF）对高 Ca2?培养细胞的影响。
经过 96 小时的 “培养之旅”，他们通过免疫荧光检测发现，高 Ca2?处理后的细胞出现了明显变化。细胞之间形成了桥粒（一种细胞连接结构，对维持细胞间的紧密连接很重要），而且出现了 K10 阳性细胞（K10 是表皮分化的重要标记蛋白，K10 阳性意味着细胞开始分化）。而在低 Ca2?环境下的细胞，主要是 K5 和 K14 阳性（这两种蛋白在增殖的细胞中占主导）。他们进一步通过 western blotting 和 qPCR 验证，发现高 Ca2?培养的细胞中 K1 和 K10 的表达显著增加。有趣的是，额外添加维生素 C 和 KGF 并没有让 K1 和 K10 的表达进一步提高，反而有所降低。研究人员推测，这可能是因为 2D 细胞培养中的细胞总体处于一种过度增殖的状态，即使它们在分化。
分化与代谢向氧化磷酸化转变相关
确认了高 Ca2?能诱导细胞分化后，研究人员又像好奇的探险家一样，想知道细胞分化过程中代谢会发生什么变化。他们利用 Seahorse XFe96 Flux Analyzer 这个 “代谢探测器” 进行检测。
结果发现，在 60 μM Ca2?培养基中增殖的细胞，就像一群充满活力的 “小糖消耗者”，具有更高的糖酵解活性，表现为更高的细胞外酸化率（ECAR，糖酵解过程中会产生质子，导致细胞外环境酸化，所以 ECAR 可以反映糖酵解活性）。而在 1.5 mM Ca2?培养基中培养的细胞，则像是 “氧气爱好者”，具有更高的耗氧率（OCR），表明它们的氧化磷酸化（细胞利用氧气产生能量的一种高效代谢方式）速率更高。这一结果表明，角质形成细胞从增殖到分化的转变过程中，代谢方式也从糖酵解转变为氧化磷酸化。这意味着增殖和分化的细胞，其代谢产物 NADH 和 FAD（两种参与细胞代谢的辅酶，在代谢过程中会发生氧化还原变化，且具有荧光特性）的组成会有所不同，而这正是 MPM-FLIM 技术的检测目标。
MPM-FLIM 检测到分化角质形成细胞中与代谢转变一致的变化
接下来，研究人员利用 MPM-FLIM 技术对细胞进行代谢成像，就像给细胞拍了一张 “代谢照片”。他们选择 750 nm 和 900 nm 的激发波长，分别针对 NADH 和 FAD 进行成像，同时尽量减少角蛋白（表皮中的一种结构蛋白）的光谱干扰。
他们发现，经过 96 小时高 Ca2?处理的细胞，在 NADH 通道中荧光寿命变长，在 FAD 通道中荧光寿命变短。通过对荧光衰减曲线进行双指数拟合分析，他们发现高 Ca2?处理的细胞中，游离 NADH 和 FAD 的比例降低。这与之前代谢通量分析中细胞从糖酵解向线粒体呼吸转变的结果一致，说明 MPM-FLIM 技术能够检测到细胞分化过程中的代谢变化。
用 MPM-FLIM 对角质形成细胞分化进行 96 小时的纵向研究
研究人员并不满足于此，他们还想看看细胞在分化过程中的动态变化。于是，他们利用 MPM-FLIM 技术，对高 Ca2?处理的 HEKn 细胞进行了长达 96 小时的监测，就像给细胞的分化过程拍了一部 “纪录片”。
在这个过程中，他们发现随着时间推移，细胞的代谢状态逐渐发生变化，游离 NADH 和 FAD 的荧光比例持续下降，这进一步证实了细胞在向氧化磷酸化转变。通过对 MPM-FLIM 数据进行 k-means 聚类分析（一种数据分析方法，可以将数据根据相似性进行分类），他们发现这些数据可以很好地对应到实验的每一天，这意味着 MPM-FLIM 技术提供的信息有望用于自动分类方案，来表征角质形成细胞的分化状态。
在讨论部分，研究人员表示，他们的研究证明了 MPM-FLIM 技术可以作为监测角质形成细胞分化的有效工具。角质形成细胞在高 Ca2?处理下，确实出现了从糖酵解到氧化磷酸化的代谢转变，这与其他细胞类型的分化代谢趋势相似。
不过，这项研究也有一些局限性。研究中使用的 2D 组织培养模型虽然简单可靠，但与真实的皮肤结构相比，还是有差距。而且在分析 FLIM 数据时，目前只能针对整个图像进行，细胞特异性分析和自动化图像分割还存在困难，现有的细胞分割算法在处理分化后期的角质形成细胞时效果不佳。另外，组织自发荧光复杂，还受到其他因素影响，而且 MPM-FLIM 技术在获取活细胞自发荧光时，对光子计数和信噪比要求较高，采集速度也有待提高。
尽管如此，这项研究依然意义非凡。它首次将 MPM-FLIM 数据与角质形成细胞不同分化阶段的代谢状态联系起来，为器官型细胞培养的质量控制提供了一种非侵入性的监测方法。未来，研究人员可以进一步开发图像处理工具和机器学习模型，提高分析的准确性和自动化程度，让这项技术更加完善。也许在不久的将来，MPM-FLIM 技术会成为生物医学研究中不可或缺的 “得力助手”，帮助科学家们更好地探索细胞的奥秘，推动再生医学和皮肤病治疗等领域的发展。
