超分子荧光探针助力实时窥探大脑中肾上腺素的 “神秘活动”

为解决精准测量大脑中 EP 动态变化的难题，华东师范大学的研究人员开展超分子荧光探针研究。他们开发出 CMG2，实现对 EP 高灵敏、快速检测。该成果有助于理解 EP 相关生理病理过程，强烈推荐科研读者阅读。

　　

在神秘的大脑世界里，有一种名为肾上腺素（Epinephrine，EP）的物质，它就像一个忙碌的 “小管家”，在神经系统的各种生理和病理过程中都发挥着至关重要的作用。想象一下，大脑是一个庞大而复杂的城市，EP 就是城市里的交通指挥员，它指挥着神经信号的传递，维持着城市的正常运转。当 EP 的 “指挥工作” 出现问题时，这个城市就会陷入混乱，许多神经退行性和精神疾病，如癫痫、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）和帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等，都可能找上门来。

然而，想要深入了解 EP 在大脑中的 “工作细节”，可没那么容易。EP 和其他神经递质长得太像了，尤其是多巴胺和去甲肾上腺素，这就好比是三胞胎，很难区分谁是谁。而且，EP 释放速度极快，就像闪电一样，想要抓住它的动态变化十分困难。目前已有的测量 EP 的方法，比如质谱法、液相色谱法和毛细管电泳法等，都不太适合在活体中使用，更别说实时监测和追踪活细胞和大脑内 EP 的动态变化了。这就好比你想观察一只敏捷的小鸟在森林中的飞行轨迹，但手里的工具却只能看到静止的画面，根本跟不上小鸟的速度。因此，开发一种能够在细胞和活体水平上可靠、快速、特异性地测量 EP 动态变化的方法，成了科学家们亟待解决的问题。

为了攻克这个难题，华东师范大学的研究人员经过不懈努力，在《Nature Communications》期刊上发表了一篇名为 “Probe for epinephrine imaging and biosensing in neurons and living brain of freely behaving animals” 的论文。他们成功设计并合成了一系列基于主客体相互作用的超分子荧光化学计量计（chemodosimeters），就像是为 EP 量身定制的 “专属探测器”，可以对 EP 进行实时成像和定量分析。这项研究不仅让我们能够更清楚地看到 EP 在大脑中的 “一举一动”，还为理解 EP 相关的生理和病理过程提供了重要的工具。

研究人员在这项研究中主要用到了以下几个关键技术方法：首先是主客体相互作用技术，通过将不同的主体分子（如具有不同空腔大小的葫芦 [n] 脲）与含有硼酸基团和活性二氟苯酚酯的客体分子（如苯乙烯基吡啶盐染料）结合，构建出对 EP 有特异性响应的超分子荧光化学计量计。其次，利用核磁共振（NMR）、质谱（MS）等技术对合成的化合物进行表征和结构分析，了解它们的性质和相互作用。此外，运用荧光光谱技术，对 EP 与化学计量计的相互作用进行监测，从而实现对 EP 的定量检测和成像。最后，借助荧光共聚焦显微镜、多通道光纤荧光光谱等成像技术，在神经元、脑组织切片、斑马鱼和小鼠大脑等不同模型中对 EP 进行成像和动态监测。

下面我们来详细看看研究人员都有哪些重要发现：

• 设计和合成对 EP 具有高时间分辨率的选择性识别的主客体超分子荧光化学计量计：研究人员就像一群心灵手巧的工匠，精心合成了三种苯乙烯基吡啶盐染料（G1、G2 和 G3）作为客体分子，它们带有硼酸基团和活性氟化苯酯，能够与儿茶酚型和单胺型神经递质发生反应。同时，引入不同空腔大小的葫芦 [n] 脲（CB [n] s）作为主体分子，增强对客体分子的限制作用，还加入亚甲基蓝（MB）作为荧光参考分子，实现定量检测。经过一系列的筛选和优化，发现 G2 与 CB¹⁰形成的 CMG2 对 EP 的响应速度最快、选择性最高。这就好比在众多零件中，找到了最适合的组合，让 “专属探测器” 能够精准地识别 EP。
• CMG2 对 EP 的荧光滴定及机理评估：研究人员对 CMG2 与 EP 的相互作用进行了深入研究。他们发现，随着 EP 浓度的增加，CMG2 的 F₅₇₀通道荧光强度急剧下降，而 F₆₉₅通道保持不变，且相对荧光强度与 EP 浓度在一定范围内呈现良好的线性关系，检测限低至 5.1±0.3 nM。通过多种技术手段，如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、核磁共振（NMR）光谱和飞秒瞬态吸收（fsTA）测量等，研究人员揭示了 CMG2 与 EP 的结合模式和荧光变化机理。原来，CMG2 就像一个聪明的 “捕手”，通过 G2 的两个识别位点与 EP 结合，并将其包裹在 CB¹⁰的空腔内，形成稳定的复合物，同时荧光发生变化，从而实现对 EP 的检测。
• 在神经元、脑组织和斑马鱼中对 EP 进行荧光成像和实时定量：研究人员还测试了 CMG2 在生物系统中的实用性。他们发现 CMG2 具有良好的生物相容性和低细胞毒性，就像一个友好的 “访客”，不会对细胞造成太大的伤害。在神经元中，CMG2 能够精准地定位到细胞膜上，并且可以实时监测电刺激后 EP 的动态变化，发现电刺激后神经元细胞膜上的 EP 浓度在约 4.0 秒内增加了约 35 倍。在脑组织切片中，研究人员观察到不同脑区对电刺激的 EP 响应存在差异，如 CA1、Cpu 和 LD 区域的 EP 浓度在电刺激后显著增加，而 S1BF 区域变化较小。在斑马鱼中，同样发现电刺激后 EP 浓度明显上升。这表明 CMG2 这个 “专属探测器” 在不同的生物模型中都能发挥作用，帮助我们了解 EP 在不同组织中的分布和变化情况。
• 对小鼠 26 个脑区的 EP 进行实时监测和定量：为了进一步探究 EP 在小鼠大脑中的动态变化，研究人员将 CMG2 应用于活体小鼠实验。他们首先验证了 CMG2 在大脑中的稳定性、代谢途径和生物毒性，确保它在小鼠体内能够安全有效地工作。然后，通过植入光纤微阵列，利用多通道光纤荧光光谱技术，对小鼠 26 个脑区的 EP 水平进行实时监测。当小鼠受到尾悬刺激（模拟恐惧应激）时，研究人员发现杏仁核、丘脑、下丘脑、海马体和纹状体等脑区的 EP 水平明显升高。这就像是发现了大脑在面对恐惧时的 “应急按钮”，这些脑区中的 EP 就像一群 “应急队员”，迅速响应，帮助大脑应对压力。

在这项研究中，研究人员成功开发了一种基于主客体相互作用的超分子荧光化学计量计 CMG2，它能够在体外和体内以高亲和力、高灵敏度和快速的动力学（约 240 ms）监测 EP 的活性。通过一系列实验，研究人员从神经元到整个大脑，实现了对 EP 浓度、分布和动态变化的实时监测，发现了小鼠在恐惧诱导的应激状态下，特定脑区的 EP 浓度显著增加。这一成果为深入了解 EP 在大脑中的生理和病理作用提供了重要的技术支持，就像为大脑研究打开了一扇新的窗户，让我们看到了以前从未发现的秘密。

此外，这项研究还为设计和合成用于特异性和灵敏检测神经元、组织和小鼠大脑中的神经递质、氨基酸和蛋白质的化学计量计提供了一种新的方法，为未来神经科学的研究开辟了新的道路。它可能帮助科学家更好地理解神经系统疾病的发病机制，为开发新的治疗方法提供理论依据，就像为攻克神经系统疾病提供了一把新的 “钥匙”，有望开启治疗这些疾病的新篇章。