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为解决微生物群落空间模式形成机制不明及难以预测的问题，研究人员开展多因素影响微生物群落空间模式的研究。他们分析相关因素、实验装置和建模框架，其成果有助于理解和预测微生物群落模式，值得科研读者一读。
摘要
多物种生物膜的特性取决于物种在空间中的排列方式。这些模式如何形成是一个复杂且在很大程度上尚未解决的问题。在此，作者[第一作者单位] 的研究人员综合了已知的影响模式形成的因素，确定了它们之间的相互依赖关系和反馈回路，并讨论了理清这些因素影响的方法。最后，作者[第一作者单位] 的研究人员提出了一个跨学科研究计划，有望对微生物群落中的模式形成建立预测性理解。
引言
人们对微生物的理解在很大程度上基于在充分混合的液体培养物中进行的实验，这类实验相对易于控制且重复性高。然而，将细胞悬浮在液体中并进行混合，忽略了大多数微生物在自然环境中面临的重要现实：可供附着和生长的表面、由于种群密集而受到的运动限制，以及通过吸收和释放分子显著改变局部物理和化学环境的能力 。
群落的空间结构可以通过环境外部施加，也可以通过细胞的自组织形成。在许多自然环境中，水、营养物质或空间的可用性将生长限制在特定位置，例如土壤孔隙或表面的液滴。因此，微生物群落会形成空间上隔离但可能相互关联的亚种群集合。然而，在没有外部非生物空间结构的情况下（例如，见图 1 中的示例），空间结构也可能出现。在这些情况下，空间结构是细胞生长、移动和在空间中自我排列方式的结果。尽管这两种形式的空间结构都具有重要的生态和进化意义，但 作者[第一作者单位] 的研究人员在此关注的是通过自组织形成的空间结构。
自组织空间模式源于单个细胞的生长和运动。细胞的生长和运动由其局部生物、化学和物理微环境决定。反过来，细胞也塑造了它们的局部环境。因此，群落的空间排列是一种复杂的特性，由细胞与其环境之间的反馈回路产生。这种空间排列是影响微生物群落动态、功能和进化的基本特性。因此，理解微生物群落的生态学和进化需要深入了解空间模式在结构化细胞群体中是如何产生的。
虽然许多研究已经确定了影响模式形成的因素，但 作者[第一作者单位] 的研究人员仍然缺乏对细胞及其环境特性如何影响多物种群落中空间模式的一般性预测性理解。进展缓慢有几个原因。首先，许多研究使用由两个具有工程化相互作用的近等基因菌株组成的合成群落。目前尚不清楚这些发现是否以及如何推广到由物理和生物学特性不同的多个物种组成的群落。一些研究已经开始使用天然多物种群落，但这些系统复杂性的增加使得难以对细胞和 / 或其环境的特性如何决定观察到的模式做出定量预测。其次，模式形成受到细胞及其环境的多种特性的影响，包括细胞形状、种间相互作用、初始细胞密度或流体流动。许多这些因素已经被单独详细研究过；然而，它们往往是相互依赖的。这使得实验解释变得复杂，理想情况下在实验设计阶段就应予以考虑。此外，细胞特性、它们的相互作用以及由此产生的空间模式之间的关系很复杂：不同的机制可以产生高度相似的模式（图 2），而环境的细微变化可能会显著改变最终的模式。因此，确定观察到的模式背后的参数和过程并不明显，细胞及其环境的独特特性如何驱动微生物群落中的模式形成仍然是一个重要的未解决问题。
在这篇综述中，作者[第一作者单位] 的研究人员分析了驱动微生物群落空间模式形成的生物学、化学和物理因素，并强调了以反馈回路形式连接它们的相互依赖关系。作者[第一作者单位] 的研究人员描述了通常用于研究模式形成的实验装置，并强调了不同因素在每个装置中的相关性。最后，作者[第一作者单位] 的研究人员提出了一组互补的建模框架，可用于描述和预测观察到的模式。为简单起见，作者[第一作者单位] 的研究人员主要关注基于实验室装置的两物种群落。然而，这里讨论的大多数概念可以扩展到更复杂的自然系统，作者[第一作者单位] 的研究人员的总体目标是为确定微生物群落中模式形成的一般原则奠定框架基础。通过综合现有研究和概念，作者[第一作者单位] 的研究人员强调了研究空间模式时应考虑的因素，并强调了整合微生物生态学和生物物理学领域知识的价值。
是什么产生了空间模式？
空间模式由微生物群落中每种细胞类型在空间中的位置决定。这些模式可以使用几个汇总统计数据来描述，例如通过计算群落组成或不同物种的混合程度 。已经开发了许多不同的指标，作者[第一作者单位] 的研究人员在表 1 中给出了一个非详尽的概述。重要的是，这些汇总统计数据取决于描述系统的尺度：不同物种的细胞在一定尺度上可能看起来混合在一起，但在足够小的尺度上，它们通常被自身类型的细胞包围。
微生物群落中的模式形成取决于高维参数空间。影响空间模式形成的因素大致可分为三类：单个细胞的特性、其局部环境的特性以及细胞与环境相互影响的反馈回路的特性（表 2 和图 3a）。
细胞
空间模式源于单个细胞在空间中的位置。这些位置是动态的：随着时间的推移，细胞生长和移动，因此空间模式可能会发生变化。因此，与单个细胞相关的三个因素与模式形成相关：初始位置、生长和死亡以及运动。
首先，如图 2 所示，细胞相对于彼此的初始位置会影响模式形成。在许多实验中，如菌落范围扩展实验，细胞类型的初始比例、细胞密度和细胞定位的变化会产生不同的模式。虽然已知细胞的初始配置与模式形成相关，但在实验室中系统地研究初始位置与空间结构之间的关系具有挑战性，因为难以通过实验控制不同物种的精确位置（但见参考文献 45）。因此，随机性在实验中常常影响细胞的初始配置，进而影响模式形成。然而，空间模式的某些统计特性，如组成或分类程度，对这些随机波动可能具有鲁棒性。
细胞的生长和死亡率也塑造了空间模式。细胞相对于其邻居的生长速率决定了哪种细胞类型将占据先前的空位或将相邻细胞推开。死亡率也可以通过释放空间或改变生长发生的位置来影响模式。细胞的生长和死亡率主要取决于细胞对其局部化学和物理环境的反应，这将在后续章节中讨论。然而，它们也可以通过与相邻细胞的直接接触依赖性相互作用来改变。此外，噬菌体和捕食导致的细胞死亡也会改变空间模式。
最后，主动和被动运动可以影响模式形成。主动运动发生在微生物利用鞭毛和菌毛等附属物消耗能量在环境中移动时。这种运动可以是无方向的，也可以由环境刺激（如趋化性）引导。被动运动是对外部物理力（如流体流动）的反应，它可以影响细胞在表面的初始分布，从而影响隔离程度。此外，随着微生物生长并在其局部环境中拥挤，细胞在相互推挤时也会移动。主动和被动运动都受到细胞环境几何形状的限制，并受到细胞物理特性（如大小、形状和粘附性）的影响。例如，细胞形状或大小的差异可导致细胞自发分选。
局部物理和化学环境
物理和化学环境特性通过影响细胞的生长和运动来影响模式形成（图 3b）。在空间结构化系统中，即使在微米尺度上，环境特性也往往是异质的，每个细胞都经历不同的局部微环境。
细胞的物理环境是指通过物理机制影响细胞生长和运动的所有特性，如温度、表面特性和水化水平（见表 2）。物理环境通过物理力的作用强烈影响细胞生长和运动。这些力可以由细胞所处装置的物理约束、它们生长的介质或其他细胞施加。例如，限制细胞生长空间的物理约束以及与该空间边界的摩擦，可以影响细胞在环境中被困的程度。环境的粘度也会对细胞施加不同的力。粘性较高的环境会限制细胞运动并促进细胞类型的隔离。细胞自身也会改变物理环境。例如，细胞可能产生细胞外基质，它可以调节渗透压并促进群落的扩展。此外，通过生长和占据空间，细胞导致局部拥挤，这对其他细胞施加压力。这种拥挤可以导致集体细胞运动、影响竞争结果，甚至导致生长停滞。这些力的影响取决于细胞的特性，如大小、形状和刚性。
细胞的化学环境由代谢物、毒素和其他化学物质的浓度和通量定义。它通过决定细胞积累生物量和分裂的速率来影响生长。化学环境还可以通过沿化学梯度的趋化作用或通过普遍上调运动性来影响细胞运动。总体营养可用性也是一个重要因素，因为它决定了生长停止前达到的最终密度。化学特征并不总是能与物理效应区分开来。例如，表面活性剂和胞外多糖等化学物质通过影响表面张力和粘度来改变物理环境。流体流动等物理特性也可以改变分子在空间中的分布，改变化学景观。此外，细胞的更高拥挤程度导致更高的代谢物摄取，并增加了化学环境的异质性。
细胞与环境之间的反馈回路
虽然环境特性影响细胞生长和运动，但细胞反过来也影响环境（图 3b）。例如，物理环境受到细胞拥挤的影响，而化学环境则通过营养物质的消耗以及代谢物的分泌或泄漏而改变。此外，细胞环境对其运动和生长的影响取决于细胞的代谢能力、运动机制、细胞形状、表面特性和许多其他细胞特性。因此，细胞和环境特性之间存在许多相互依赖关系和反馈回路。
细胞与其环境之间紧密的反馈回路对空间模式有两个关键影响。首先，影响空间模式形成的因素不能被独立对待。由于生长、运动和环境特性相互交织，从实验数据中分离单个因素对空间结构的影响具有挑战性。例如，在微流体装置中改变流速既会改变施加在微生物上的物理力，又会增加营养物质引入和代谢副产物去除的速率。如果流速的变化导致空间结构的改变，那么确定其原因就很困难。因此，仔细量化这些不同的影响及其相互作用对于深入了解模式形成的机制至关重要。
其次，由于附近的细胞共享相同的微环境，这些反馈回路产生了新出现的细胞间相互作用。当一个细胞改变其局部化学或物理环境时，这种变化会影响相邻细胞，导致它们生长或运动方式不同，进而影响空间结构。例如，给定的微生物细胞可以通过分泌改变化学环境的代谢物 “交叉喂养” 其他细胞，或者通过移动到新位置导致拥挤，这两者都会影响相邻细胞的生长和运动。
解释空间模式的挑战
在本节中，作者[第一作者单位] 的研究人员将使用一个简单的概念模型来说明上述相互依赖关系如何使人们难以对细胞及其环境特性如何影响空间模式形成预测性理解。作者[第一作者单位] 的研究人员考虑两种营养缺陷型菌落中的模式形成，例如，两种各自无法产生一种必需氨基酸，但可以通过向环境中分泌这些氨基酸来互补彼此生长的菌株。可以通过改变外部提供的生长培养基中氨基酸的浓度来调节依赖程度。随着外部氨基酸浓度的增加，依赖程度减弱，作者[第一作者单位] 的研究人员预计混合程度会降低。然而，在一种菌株的运动性随着氨基酸浓度增加而增加的情况下，作者[第一作者单位] 的研究人员发现，虽然混合程度最初会降低，但在较高的外部氨基酸浓度下，它会再次增加（图 4a）。为了理解这种现象，作者[第一作者单位] 的研究人员需要考虑氨基酸浓度如何单独影响每种物种：氨基酸浓度的增加不会影响第一种菌株的模式形成（图 4b）。然而，对于第二种物种，作者[第一作者单位] 的研究人员观察到混合程度增加（图 4c）。这两个观察结果，结合 作者[第一作者单位] 的研究人员对菌株之间相互作用的了解，使 作者[第一作者单位] 的研究人员能够理解当它们一起生长时形成的空间模式。
这些模拟表明，识别因实验操作而改变的所有因素至关重要。在 作者[第一作者单位] 的研究人员的例子中，只有通过量化化学环境的变化如何影响细胞运动性，才能解释观察到的空间模式变化（图 4）。重要的是，通常事先不清楚哪些因素可能会受到实验操作的影响。在当前的例子中，细胞混合与相互作用强度之间出乎意料的非单调关系可能会提醒实验人员存在未识别的混杂因素（图 4a），从而导致进行额外的对照实验（图 4b、c）。然而，在许多情况下，混杂因素的影响可能更微妙，很容易被忽略，从而可能导致对实验结果的错误解释。因此，始终意识到潜在隐藏混杂因素的存在并相应地规划对照实验至关重要。
在本文的其余部分，作者[第一作者单位] 的研究人员将讨论如何使用实验和计算方法对细胞与其环境之间的这些反馈回路建立定量理解。
研究空间模式的实验装置
在前面的章节中，作者[第一作者单位] 的研究人员认为环境是塑造微生物群落空间结构过程的重要决定因素。因此，在不同环境中生长的相同细胞类型可能表现出不同的空间模式。例如，细胞能否在二维或三维空间中生长、物理边界的形状以及营养供应的时空动态，都可以定性或定量地改变新出现的模式。接下来，作者[第一作者单位] 的研究人员从这个角度分析一些最常用的实验装置，并讨论空间模式如何受到每个装置特性的影响（图 5，表 3）。
琼脂平板上的菌落
菌落生物膜是在含有营养物质的表面上生长的宏观（毫米到厘米）群落 。在典型实验中，将细胞类型的混合物放置在琼脂平板的中心，细胞在琼脂 - 空气界面向外生长。扩展的菌落在初始指数生长阶段后，以恒定速度扩展，不会遇到物理边界。径向生长速率由菌落边缘的物理力决定，而垂直生长受到底物耗尽的限制。因此，活跃生长的种群仅限于菌落边缘，不同谱系在那里竞争占据空位。因此，生长较快的谱系更有可能在生长的菌落中形成扇形区域。然而，即使所有谱系的生长速率相同，由于遗传漂变也会形成扇形区域。细胞类型之间的相互作用也会调节空间模式，例如，代谢依赖性通常会导致形成较小的、混合程度更高的扇形区域。虽然菌落生物膜主要用于研究孤立的生物膜，但这些测定也可用于研究生物膜之间的相互作用。
菌落实验缺乏单细胞分辨率，更常用于研究群体水平的行为。谱系生长速率可以通过对菌落进行破坏性采样，并通过计数菌落形成单位比较初始和最终谱系频率来量化。然而，这无法捕捉相互作用的时间和空间依赖性，并且将代谢和物理相互作用的影响合并在一起。成像也可以提供有关细胞类型之间相互作用的信息。例如，最适菌株的扇形区域在扩展过程中宽度往往会增加，并且当代谢依赖性更强时，混合程度会增加。许多其他因素，如细胞形状、物理相互作用、杀伤相互作用，甚至延迟时间，都会影响扇形区域的形状。虽然通常很难获得单细胞生长速率和运动性，但自适应显微镜技术允许跟踪菌落边缘的单个细胞。此外，最近开发了其他方法来研究不同空间分辨亚群中细胞的转录和代谢活性。
微流体流动池中生物膜
在微流体装置中，细胞附着在表面、彼此附着或被物理捕获在生长室中，而营养物质通过它们浸泡在其中的液体培养基提供。这些装置可以设计为开放系统，化学物质不断流入和流出系统，也可以设计为封闭的批次系统，其中接种细胞和化学物质后密封装置。
最简单的微流体装置由矩形流动通道组成，生物膜在其中附着在玻璃表面生长。通过时间推移显微镜，可以跟踪细胞从初始表面附着、微菌落形成，到三维生物膜的生长和成熟，再到最终生物膜分散的整个生命周期。图像分析技术的最新进展允许在多达几千个细胞的生物膜中以单细胞分辨率分析空间模式。此外，可以获得不同亚群的转录组谱。
流动池生物膜与菌落生物膜在几个重要方面有所不同。首先，化学环境在性质上不同。在流动池中，底物和氧气都从生物膜 - 液体界面进入，而在菌落中心，它们从相反的两侧进入（在菌落边缘，梯度更为复杂）。其次，相关的物理力不同，流动池中主要是剪切力，而菌落生物膜中主要是摩擦力。最后，虽然菌落生物膜大多是孤立生长的，但流动池中通常包含许多通过细胞和化学物质交换相互连接的独立生物膜。上游生物膜可以显著改变下游生物膜的化学环境。通过被动和主动运动，细胞可以在生物膜之间迁移，从而即使在成熟的生物膜中也能实现空间排列的重大变化。
微流体生长室中的单层细胞
微流体生长室可用于物理限制细胞以单层形式生长，便于在单细胞水平上量化生长速率和基因表达。这些装置通常由一个流动通道组成，小的生长室从侧面分支出来，形成许多独立的隔室，与流体流动隔离。细胞的高密度和有限的流动可以产生微尺度的化学梯度和短程细胞 - 细胞相互作用，类似于三维生物膜中的情况。
通过将生长限制在二维空间中，在微流体生长室中跟踪细胞的生长和运动比在三维生物膜中要容易得多。因此，这些生长室非常适合详细研究细胞相对于营养源或其他细胞的位置如何影响其生长和活性。然而，生长室的几何约束会施加很强的物理力，这可能会影响细胞生理学和模式形成。这可能使研究大小或生长速率差异很大的细胞类型具有挑战性。例如，生长室很快就会被生长最快的细胞类型占据。然而，通过巧妙的设计可以避免这种情况：底部呈波浪形的微流体芯片可以捕获细胞，并允许在同一生长室内更稳定地共存不同谱系。
琼脂垫上的微菌落
在琼脂垫实验中，将极低密度的培养物添加到一块琼脂糖凝胶上，并用盖玻片覆盖。细胞的初始位置通常是随机的，但可以通过打印初始模式来控制。这些细胞随后生长成多达几百个细胞的微菌落。与微流体生长室一样，细胞主要被限制在单层生长，使用传统显微镜即可进行单细胞分辨率成像。然而，与生长室不同的是，细胞在另外两个维度上可以完全自由移动。因此，琼脂垫可用于研究细胞对某种信号的长距离主动运动，例如对另一种细胞类型在不同微菌落中分泌的化学信号的运动。
虽然微流体方法需要专门的设备且设置起来具有挑战性，但琼脂垫相对易于使用，使其成为高通量筛选物种间相互作用的理想选择
