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为解决纤维素酶生产中翻译和分泌机制不明的问题，研究人员开展了关于丝状真菌中 PoTma15 蛋白的研究，发现它影响翻译延伸和纤维素酶产量。该研究为提高纤维素酶产量及利用丝状真菌生产异源蛋白提供新思路，值得科研读者一读。
在生物能源和生物化工领域，木质纤维素生物质是一种极具价值的可再生碳源，它能转化为生物燃料和高附加值的生化产品。丝状真菌，如木霉（Trichoderma）、曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium）等，有着强大的合成和分泌（半）纤维素酶的能力，这些酶可用于食品、洗涤剂、畜牧业饲料添加剂、纺织以及制浆造纸等多个行业，是基于可再生木质纤维素生物质的可持续生物生产的关键。
长期以来，大多数关于（半）纤维素酶生产的研究都集中在转录调控机制和提高酶基因水平上。虽然转录水平调控在（半）纤维素酶生产中起着重要作用，许多转录因子通过激活或抑制纤维素酶基因转录来影响酶蛋白的产生，但实际上，真核生物的转录和翻译在细胞内是在不同空间进行的，转录发生在细胞核，而翻译在细胞质核糖体，且翻译控制在真菌生长、细胞形态、分生孢子形成、毒力和耐盐性等方面也发挥着作用。在纤维素酶高产菌株中，翻译、分泌以及分泌酶的周转等过程，可能比转录更能限制纤维素酶产量的进一步提高。然而，目前对于纤维素酶生产过程中的蛋白质翻译和分泌环节，人们了解得还很少。
为了深入探究纤维素酶生产过程中蛋白质翻译和分泌的机制，作者[第一作者单位] 的研究人员在《Microbiome》期刊上发表了题为 “PoTma15, a translation - machinery - associated protein, affects cellulase production in Penicillium oxalicum” 的论文。研究发现了一种与翻译机器相关的蛋白质 PoTma15，它在丝状真菌中保守存在，却未在酵母、植物和动物中发现。PoTma15 与纤维素酶和细胞外蛋白的产生呈正相关，删除 Po* tma15 * 基因会降低纤维素酶产量，而过表达该基因则能提高产量，并且 PoTma15 是通过影响翻译延伸过程来影响酶蛋白产生的。这一发现不仅为拓宽纤维素酶生产途径提供了新的思路，还有望将其作为靶点，利用丝状真菌作为细胞工厂来提高其他异源蛋白或生物产品的产量。
研究人员在开展这项研究时，主要运用了以下关键技术方法：一是通过串联亲和纯化（TAP）结合质谱（MS）技术，来鉴定蛋白质之间的相互作用；二是构建不同的突变菌株，包括基因缺失菌株、过表达菌株以及融合标签的菌株等，用于研究基因功能；三是利用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）技术分析基因的转录水平；四是进行酵母双杂交（Y2H）实验，验证蛋白质之间是否存在直接相互作用。
下面来详细看看研究结果：
- 翻译机器相关蛋白 PoTma15 在转录因子 PoXlnR 的假定相互作用蛋白中被发现：研究人员原本想利用 TAP-MS 技术捕获并鉴定 PoXlnR 的辅助因子。他们构建了 PoXlnR-TAP 菌株，以野生型（WT）菌株作为对照进行实验。经过两步串联纯化后，对洗脱液进行分析。SDS-PAGE 和 Western blot 结果显示存在多个特异性条带，LC/MS-MS 鉴定发现有 173 种蛋白质可能与 PoXlnR 相互作用，其中 PDE_06571（后来被命名为 PoTma15）最初被认为是 PoXlnR 的假定相互作用蛋白之一，但后续研究表明它与翻译机器有关。
- PoTma15 在丝状真菌中保守且广泛分布于真菌菌丝中：通过 BLASTP 搜索发现，PoTma15 在经典模式生物中没有同源蛋白，但在各种丝状真菌中进化上保守，与多种丝状真菌的同源蛋白有较高的同一性。研究人员构建了 Tma15-GFP 菌株来研究 PoTma15 的亚细胞定位，结果显示它在真菌菌丝中广泛分布。同时，通过 qPCR 和转录组数据分析发现，Po* tma15 * 基因的转录受纤维素诱导，并且与纤维素酶基因转录和产量呈正相关。
- PoTma15 与纤维素酶产量正相关：为研究 PoTma15 的生物学作用，研究人员构建了 Po* tma15基因缺失菌株（Δ tma15*）和过表达菌株（OE* tma15*），并与 Po* xlnR基因缺失和过表达突变体进行比较。在 VMMC 琼脂平板上培养时，OE tma15和 OE xlnR菌株的菌落大且有纤维素分解晕圈，而 Δ tma15和 Δ xlnR菌株的菌落小且无晕圈。在液体培养基中培养后测定酶活性和细胞外蛋白浓度，发现 OE tma15和 OE xlnR菌株的细胞外蛋白产量、滤纸酶活性（FPA）和淀粉酶活性较高，Δ tma15 * 菌株则较低，表明 PoTma15 蛋白与细胞外纤维素酶正相关。
- PoTma15 与纤维素酶基因的转录没有直接关联：由于细胞外蛋白主要在转录水平调控，而 PoTma15 与纤维素酶产量相关，研究人员最初假设它可能调节相关基因转录。但对 WT、Δ* tma15和 OE tma15菌株在 VMMC 和 VMMG 液体培养基中培养后，检测相关基因的转录水平发现，删除 Po tma15基因不影响主要（半）纤维素酶和淀粉酶基因的转录水平，OE tma15 * 突变体中纤维素酶基因也只是略有上调，这说明 PoTma15 蛋白可能与转录调控没有直接关系。
- PoTma15 与翻译机器相关：研究人员构建了 Tma15-TAP 菌株进行 TAP-MS 实验，发现 PoTma15 的假定相互作用蛋白中，排名前三的分别是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）翻译机器相关蛋白 Tma19 的同源蛋白、翻译延伸因子 eIF5A 的同源蛋白以及核糖体蛋白 S28 的同源蛋白，这表明 PoTma15 与翻译机器相关。酵母双杂交实验显示 PoTma15 与 PoXlnR 没有直接相互作用，但分析发现它们的假定相互作用蛋白存在重叠，暗示两者可能通过翻译机器成分间接关联。
- Δ tma15突变体对环己酰亚胺的翻译抑制作用具有抗性 **：为确定 PoTma15 的功能是否与翻译有关，研究人员在培养基中添加环己酰亚胺（CHX，一种真核翻译延伸抑制剂）。结果发现，添加 CHX 后，WT 和 OE* tma15菌株的细胞外蛋白产量和 FPA 受到显著抑制，而 Δ tma15突变体受影响较小，表明 Δ tma15 * 突变体对环己酰亚胺的翻译抑制作用具有更强的抗性。
综合研究结论和讨论部分的内容来看，PoTma15 最初被认为与转录因子 PoXlnR 有关，但实际上它与翻译过程密切相关。虽然添加标签实验发现 XlnR-TAP 菌株的纤维素酶产量比 WT 更高，推测是 TAP 标签影响了 PoXlnR 的功能，但这也从侧面反映出研究过程的复杂性和有趣之处。从 PoTma15 与 PoXlnR 的关系来看，由于转录因子在细胞核中发挥作用，而 PoTma15 位于细胞质，结合其他研究中一些转录因子在细胞质中也有分布的情况，推测 PoTma15 可能与 PoXlnR 的新合成机制有关。同时，PoTma15 与翻译延伸因子 eIF5A 和 Tma19 相关，且 Δ* tma15 * 突变体对环己酰亚胺有抗性，这些都表明 PoTma15 可能参与翻译延伸过程。不过，翻译机器组件众多，PoTma15 具体与哪个组件直接相互作用以及其缺失导致环己酰亚胺抗性的机制，还需要进一步深入研究。
这项研究的重要意义在于，首次在产纤维素丝状真菌中鉴定出 PoTma15 这种与翻译机器相关的蛋白质，并发现它可用于提高纤维素酶产量。这不仅为理解纤维素酶生产的机制提供了新视角，还为未来利用丝状真菌作为细胞工厂生产其他异源蛋白或生物产品提供了潜在的工程靶点，为生物能源和生物化工领域的发展开辟了新的道路，有望推动相关产业的进一步发展。
