探秘无金属 Ie 类核糖核苷酸还原酶 QSK 变体：解锁遗传物质合成的神秘 “密码”

为解决 R2eQSK研究空白问题，研究人员开展对其特性的研究。结果发现它能形成功能性 RNR 系统，DOPA 修饰影响活性等。该研究助力理解 RNR 进化与功能，为相关药物研发提供思路，值得科研读者一读。

　　

在生命的微观世界里，有一群 “工匠” 在默默地为遗传信息的传递努力工作着，它们就是核糖核苷酸还原酶（RNRs）。RNRs 的工作至关重要，它能把核糖核苷酸变成脱氧核糖核苷酸，而脱氧核糖核苷酸可是 DNA 的基本组成单位。就好像是建筑工人把普通的建筑材料加工成了建造高楼大厦（DNA）的特殊材料一样。

RNRs 根据对氧气的需求不同，可以分成三大类。其中，I 类 RNR 在有氧环境下工作，它由 R1 和 R2 两个亚基组成。R2 亚基负责产生一种自由基，这种自由基对于 R1 亚基催化反应来说必不可少，就像是一把特殊的 “钥匙”，只有它才能启动 R1 这个 “机器” 的工作。在大多数 R2 亚基中，自由基是在酪氨酸上产生的，这一过程需要相邻金属位点的帮忙。

后来，科学家们发现了一种不含金属的 R2，这可引起了不小的轰动，它被归为新的 Ie 亚类。在 R2e 中，原本在活性位点结合金属的三个谷氨酸发生了变化，出现了两种变体：VPK 和 QSK。到目前为止，很多研究都聚焦在 VPK 版本上，对它的生化特性了解得比较多。但对于 QSK 变体，科学家们知之甚少。虽然之前有研究发现一些生物仅依靠 QSK 型 RNR 来生产脱氧核糖核苷酸，但关于它的具体功能、活性机制等方面几乎还是一片空白。这就好比在探索一座神秘的岛屿时，只知道这座岛上有一些重要的东西，但具体是什么，怎么运作的，都还不清楚。正是因为这些未知，科学家们迫切地想要开展一项研究，深入了解 R2e 的 QSK 变体。

为了揭开 R2e_QSK的神秘面纱，研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Characterization of the QSK variant of the metal-free class Ie ribonucleotide reductase” 的论文。通过一系列研究，他们得出了不少重要结论，这对于我们理解生命过程中遗传物质的合成机制有着重要意义。

研究人员在开展这项研究时，用到了几个关键的技术方法。他们运用生物信息学方法，在众多基因组中寻找 RNR 相关基因，分析其分布和基因邻域；使用蛋白质表达和纯化技术，获得不同条件下表达的蛋白质；借助总反射 X 射线荧光光谱（TXRF）、液相色谱 - 质谱（LC-MS）等技术，检测蛋白质的金属含量、分析活性位点酪氨酸的修饰情况；还利用体外活性测定，判断酶的活性；最后通过 X 射线晶体学技术解析蛋白质的结构。

下面来看看具体的研究结果。

1. Ie 类 RNR 的生物分布

研究人员就像侦探一样，在基因组的 “线索库” 里寻找答案。他们搜索了基因组分类数据库（GTDB）中的物种代表性基因组，发现了 R2e_QSK和 R2e_VPK的分布很有特点。R2e_QSK主要存在于放线菌门的四个目中，尤其是放线菌目和分枝杆菌目；R2e_VPK大多出现在厚壁菌门的两个目中。而且，没有基因组同时编码这两种变体。他们还发现，有 132 个物种仅依靠 Ie 亚类 RNR 来合成 dNTP，其中 67 个物种含有 nrdF_QSK，65 个含有 nrdF_VPK 。特别的是，有 65 个物种把 QSK 版本作为唯一的 RNR，其中大部分是棒状杆菌属的物种。另外，R2e_VPK相关基因的排列顺序大多是 nrdFIE，而 R2e_QSK的基因排列则更加多样。通过这些研究，研究人员发现 R2e_QSK和 R2e_VPK的分布和基因排列差异很大，这暗示了它们在进化过程中可能受到了不同因素的影响。

2. BvR2e_QSK在不同条件下的表达及光谱表征

研究人员想知道 R2e_QSK和其他 R2 蛋白有什么不同，于是设计了不同的实验方案。他们构建了多种 BvR2e_QSK的表达载体，在大肠杆菌中进行表达，然后通过金属离子亲和层析（IMAC）和尺寸排阻层析（SEC）进行纯化。结果发现，BvR2e_QSK在没有 NrdI 时是无色的，和 NrdI 共表达时会变成黄色，但都没有显示出有活性自由基的迹象。用紫外线 - 可见光谱（UV-Vis）检测，也没有发现代表 RNR 酪氨酸自由基或 DOPA 自由基的特征峰。通过总反射 X 射线荧光光谱（TXRF）分析，发现 BvR2_QSK和 R2e_VPK一样，只含有微量的锰和铁。从这些研究结果可以看出，BvR2e_QSK在表达和光谱特征上和之前研究的 R2e_VPK有所不同，它在纯化后似乎没有形成活性自由基。

3. BvR2e_QSK的质谱分析

为了探究 BvR2e_QSK活性位点附近的酪氨酸是否发生了类似 R2e_VPK中酪氨酸的间位羟基化修饰，研究人员对不同共表达条件下产生的蛋白质进行了液相色谱 - 质谱（LC-MS）分析。结果发现，单独表达 R2 或 R2 与 NrdH 共表达时，只能检测到含有酪氨酸的肽段；而与 NrdI 共表达的样品中，既有含酪氨酸的肽段，也有含 DOPA 的肽段。进一步比较不同样品中 DOPA 与酪氨酸的比例，发现 NrdI 是 DOPA 形成所必需的，而且 NrdH 的存在会增强 DOPA 的形成，当共表达整个操纵子时，DOPA 的形成会进一步增加，这表明 R1 可能也参与了 DOPA 的形成过程。这就像是发现了一条神奇的 “生产线”，NrdI、NrdH 和 R1 在这条生产线上共同作用，促进了 DOPA 的产生。

4. BvRNR_QSK的体外活性

研究人员发现 BvR2e_QSK的活性位点酪氨酸被修饰成 DOPA 后，就想看看这个酶是否有活性。他们异源表达并纯化了 B. vaginale 的 R1，设置了体外活性检测实验，以活性的 R2e_VPK作为阳性对照。实验结果显示，不管 R2e_QSK中是酪氨酸还是 DOPA，R1 - R2_QSK复合物都不能还原 CDP。但是，当加入化学还原的 NrdI 后，在有氧环境下，含有 DOPA 的 R2e_QSK就能催化形成 dCDP，而未修饰的 R2e_QSK则不行。这说明 BvRNR_QSK的体外活性依赖于 R2 中 DOPA 的存在和有氧环境下还原态 NrdI 的参与。

5. BvR2 的结构

为了更深入地了解 BvR2e_QSK的秘密，研究人员对纯化后的蛋白质进行了结晶，并解析了两种晶体结构。一种是单独表达的未修饰的 BvR2e_QSK（BvR2_QSK-tyr），另一种是与 R1、NrdI 和 NrdH 共表达的 BvR2e_QSK-DOPA。BvR2_QSK-tyr 形成了特征性的铁蛋白折叠结构，其 N 端延伸，与另一个单体形成了较大的相互作用表面。活性位点没有金属离子，一些原本结合金属的谷氨酸被替换，位置被其他基团占据。BvR2e_QSK-DOPA 与 BvR2_QSK-tyr 结构相似，但活性位点的酪氨酸被修饰成了 DOPA。与 R2e_VPK的 DOPA 修饰结构相比，BvR2e_QSK-DOPA 与 R2e_VPK的失活态结构更相似，而且它们活性位点的氢键网络和水结构也有所不同，这可能是导致它们活性差异的原因。通过这些结构研究，研究人员从分子层面看到了 BvR2e_QSK的独特之处。

综合这些研究结果，研究人员得出结论：R2e_QSK确实能形成功能性的 RNR 系统。它和 R2e_VPK一样，不含有铁或锰，其活性位点的酪氨酸会被修饰成 DOPA，而且 DOPA 的形成依赖于 NrdI，NrdH 和 R1 可能也起到了促进作用。在体外实验中，只有含有 DOPA 的 R2e_QSK在有还原态 NrdI 存在的有氧环境下才能表现出催化活性。

这项研究意义重大。R2e_QSK在进化上连接了含金属的 Ib 类和不含金属的 Ie 类 VPK，并且在一些生物中是唯一的有氧 RNR。通过对它的研究，我们对 RNR 的进化和功能多样性有了更深入的理解。这不仅有助于我们揭示生命过程中遗传物质合成的复杂机制，还为未来开发针对相关病原体的药物提供了潜在的靶点。就好比是为我们打开了一扇通往微观生命世界的新大门，让我们看到了更多生命奥秘的一角，也为我们在医学和生物学领域的进一步探索提供了重要的线索和方向。