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为解决临床遗传诊断中 CNV 检测及诊断率问题，洛杉矶儿童医院和南加州大学研究人员开展外显子测序中 CNV 分析研究。结果显示该分析可提高诊断率，极具临床意义。推荐科研读者阅读，助您了解前沿遗传诊断进展。
在医学遗传诊断的领域里，临床外显子测序（CES）已经成为诊断罕见孟德尔遗传疾病的常规工具。然而，它在检测拷贝数变异（CNV，从基因内的缺失和重复到整个染色体的增减等变化）方面却面临着诸多挑战 。传统上，染色体微阵列（CMA）常用于检测大于 50kb 的 CNV，但在实际临床工作中，由于临床怀疑的基因组异常情况不同、临床指征差异、可获取的基因检测手段不同，以及医生的开单习惯不同，使得基因组诊断测试的选择流程十分复杂。
而且，仅根据临床怀疑或开单习惯，用 CMA 检测 CNV、用 CES 检测序列变异的经典做法，会导致较高的假阴性率。比如，致病的 CNV 可能小于 CMA 的检测分辨率，或者在常染色体隐性遗传病的诊断中，一个基因上同时存在 CNV 和单核苷酸变异（SNV）时，仅用传统方法可能无法准确诊断。此外，虽然已有研究利用 CES 数据检测 CNV，但其诊断率在不同研究中差异很大，从 1% 到约 30% 不等，这受到前期检测工作的程度（如是否在 CES 前进行 CMA 检测）、特定的患者群体、变异评估的严格程度以及所采用的生物信息学方法等多种因素影响。
为了解决这些问题，洛杉矶儿童医院和南加州大学的研究人员在《NPJ Genomic Medicine》期刊上发表了题为 “Exome copy number variant analysis in a large pediatric cohort: increased diagnostic yield and clinical impact” 的论文。研究发现，在标准的 CES 和聚焦外显子测序（FES，一种利用外显子骨干，将变异审查和解释限制在预定义临床相关基因列表的检测方法 ）工作流程中加入 CNV 分析，能够提高诊断率，这一额外诊断率达到了 4.6%。该研究还表明，这种分析方法在多种临床表型、转诊来源和不同血统的患者中都具有可行性，为临床遗传诊断提供了重要的参考依据。
在这项研究中，研究人员用到了几个关键技术方法。首先是外显子测序技术，对 1538 例具有不同临床表型的患者进行 CES 或 FES 检测。其次，使用 Somalier 工具来估计患者的遗传血统。在 CNV 检测方面，运用 NxClinical 版本 6.1 软件中的多尺度参考（MSR）算法，该算法通过创建参考模型和进行 CNV 及纯合子区域（ROH）的调用，来检测 CES 数据中的 CNV。最后，研究人员利用 R 编程环境和相关软件包进行数据分析和可视化，通过统计检验来探究不同因素对诊断结果的影响。
下面来看看具体的研究结果：
- 研究队列：研究队列包括 407 例 CES 病例和 1131 例 FES 病例，其中 206 例还进行了 CMA 分析 。患者年龄从新生儿到大于 18 岁不等，3 - 12 岁的患者居多。男性比例略高，共 836 名男性和 702 名女性。最常见的人类表型本体（HPO）术语包括全球发育迟缓、癫痫发作、小头畸形、全身张力减退、语言发育迟缓以及免疫缺陷等。在基因组血统方面，混合美洲人血统的个体数量最多，其次是欧洲人血统。
- 诊断率：研究人员评估了患者队列的诊断率在不同因素（如临床转诊来源、血统和检测类型）下的差异分布。不同转诊来源的 CNV 和 SNV 诊断率存在显著差异，血液科转诊的患者中，P/LP CNV 的比例最高，而肺科转诊的患者中 CNV 对诊断率的贡献为 0%。不同血统的患者诊断率分布相似，混合美洲人血统的患者中，P/LP CNV 和 SNV 的患病率与其他血统相比有一定特点。此外，CES 和 FES 病例中，SNV 的分类情况有所不同，总体队列的诊断率为 28.0%，额外的基于外显子的 CNV 分析在 4.6% 的患者中产生了相关（P/LP）结果 。在一些病例中，CMA 未检测到的 CNV 通过 CES 的 CNV 分析被发现，部分病例的 CMA 结果与 CES 的 CNV 分析结果存在不一致的情况。
- CNV 亚类：被分类为 P/LP 的缺失和重复大小不一，涵盖从单个外显子到整个染色体或基因组的异常。阳性病例进一步细分为小外显子和基因水平缺失、小于等于 10Mb 的缺失、小于等于 10Mb 的重复、大于 10Mb 的大且复杂的 CNV、非整倍体以及 ROH 和镶嵌病例等类别。其中，小外显子和基因水平缺失最为常见，研究还发现了一些复发性的 P/LP CNV 诊断，如 21 三体、22q11.2 缺失等，并且检测到了低拷贝重复介导的复发性 CNV。
- 外显子或基因水平缺失：外显子和基因水平缺失是通过 CES 分析鉴定出的最常见的 P/LP CNV 类别。例如，一名 5 周大患有大疱性表皮松解症的婴儿，其 COL17A1 基因外显子 3 - 7 发生了基因内缺失，该缺失最初未被软件检测到，经手动检查发现后，修改了 CNV 调用算法并通过 XON 阵列确认。还有一名新生儿患者，最初 CES 显示 JAK1 基因外显子 11 的变异看似纯合，但 CNV 分析表明存在重叠的基因内缺失，后续研究揭示了父母的携带情况。
- 小于等于 10Mb 的缺失和重复：小于等于 10Mb 的缺失在多个染色体区域被发现，如 22q11.2、16q23.3q24.1 等，涉及多种综合征。例如，一名 9 个月大的患者，CES 检测为阴性且未进行 CMA 检测，通过外显子数据的拷贝数分析发现了 1p32.1p31.3 缺失，解释了其症状。小于等于 10Mb 的重复也有发现，如一名 4 岁癫痫患者，在 15q22.31q23 区域存在 3.3Mb 的拷贝数增加，还有两名先天性心脏病患者在 8p23.1 区域存在不同大小的重复，与 8p23.1 重复综合征相关。
- 大于 10Mb 的大且复杂的 CNV：在 9 例 P/LP 病例中发现了大的不平衡重排，如 18p11.32p11.21 区域的大缺失，涉及染色体的衍生和重组等复杂情况，还有其他染色体区域的大缺失和复杂的拷贝数变化。
- 非整倍体：多名疑似或已知患有唐氏综合征的患者被确诊为 21 三体，还有两名未被临床怀疑患有克氏综合征的患者被发现有额外的 X 染色体（47,XXY），一名疑似特纳综合征的女性患者被发现丢失了一条 X 染色体。
- 纯合子区域和体细胞 CNV：在两个病例中，ROH 的发现具有临床意义。一名患者出现过度生长表型，被发现存在全基因组单亲二体；另一名急性髓系白血病临床缓解的患者，在 17p 涉及 TP53 基因的区域出现体细胞杂合性缺失。
- CNV 的亲代来源分析：当进行三人组 CES 检测时，NxClinical 软件可以确定 CNV 是否为新生突变，还能预测新生 CNV 发生在母源或父源染色体上。例如，一名患有生长发育不良、先天性心脏病和代谢性酸中毒的患者，其 22q11.2 缺失为新生突变；另一名呼吸衰竭患者，检测到 16q23.3q24.1 缺失，软件预测该缺失源于母源等位基因，这一发现与特定疾病相关。
- 初始诊断之外的 CNV：研究中还发现了 4 例偶然的 CNV，包括 2 个外显子缺失和 2 个微缺失，分别位于 RAD51C、BRCA1 基因以及 15q11.2、16p11.2 染色体区域。此外，一名 2 岁患有多种先天性异常和低血糖的患者，除了检测到 NF1 致病性序列变异外，CNV 分析还发现了 11p 末端缺失和 11q 末端增益。
综合研究结果和讨论部分来看，这项研究意义重大。研究人员证实了在标准的 CES 和 FES 工作流程中加入 CNV 分析，能显著提高诊断率，尤其是对于血液科、皮肤科和新生儿科转诊的患者。虽然不同血统的患者在诊断率等方面没有显著差异，但该研究涵盖了多种血统的儿科患者，具有广泛的代表性。三人组外显子 CNV 分析不仅有助于检测序列变异和 CNV 的遗传模式，还对某些疾病的诊断和预后有重要意义。此外，研究中发现的多种复发性诊断以及潜在有害的 CNV，为后续的遗传咨询和进一步研究提供了重要信息。尽管 CNV 分析目前在 CES 中尚未常规开展，但该研究表明其具有重要价值。不过，研究人员也指出，临床实验室在解释小 CNV 时要谨慎，需考虑多种因素并进行正交方法确认。总体而言，这项研究为临床遗传诊断提供了新的思路和方法，随着更多致病 CNV 的发现，CES 分析的整体诊断率有望进一步提高，从而更好地服务于患者的诊断和治疗。
