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为解决拉沙病毒（LASV）疫苗研发难题，研究人员开展 GPCv2 抗原相关研究。结果显示 GPCv2 可诱导高水平中和抗体、保护小鼠。该研究为 LASV 疫苗研发提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。
在西非的部分地区，有一种神秘而危险的病毒 —— 拉沙病毒（LASV），它是拉沙热的罪魁祸首。每年，大约有 10 万 - 30 万人不幸感染拉沙病毒，其中 5000 - 10000 人会因此丧命。不过，由于拉沙热流行地区大多是贫困的农村，缺乏精准的诊断手段，再加上拉沙热的症状和普通的发热很相似，实际感染人数可能远远不止这些。更让人头疼的是，目前还没有被批准用于治疗拉沙热的疫苗和抗病毒药物，这就像在和病毒的战斗中，我们还没有找到有效的武器。
面对这样的困境，科研人员一直在努力寻找攻克拉沙病毒的方法。虽然已经有不少拉沙热疫苗进入了研究阶段，像麻疹病毒载体的 LASV 疫苗、INO - 4500 这种 DNA 疫苗，还有 rVSV - △G - LASV - GPC 这种病毒载体疫苗等等，但是这些疫苗诱导产生的针对 GPC 的中和免疫反应要么非常弱，要么根本没有。而研究发现，从感染过 LASV 的人身上分离出的中和抗体（NAbs），却能 100% 保护动物免受致命的 LASV 攻击。这就表明，如果能研发出一种疫苗，有效诱导产生中和抗体，或许就能为对抗拉沙热带来新的希望。
拉沙病毒表面的前体糖蛋白复合物（GPC），以三聚体的形式存在，是疫苗研发的主要目标。之前研究发现，稳定的预融合糖蛋白三聚体，比如 SARS - CoV - 2、HIV - 1 和 RSV 的，能诱导强烈的 NAb 反应。所以，大家猜测，稳定保持三聚体预融合状态的重组 GPC，可能是诱导针对 LASV 的有效体液免疫反应的优质免疫原。然而，开发预融合稳定的 GPC 困难重重。一方面，预融合 GPC 三聚体表达后很容易分解成单体，导致 NAb 表位丢失，还会暴露非糖基化 GPC 内部的免疫显性非 NAb 表位；另一方面，GPC 被密集的聚糖屏蔽，免疫原性很差，而且它的序列多样，需要诱导广泛的 NAb 反应才能中和不同谱系的 LASV，这使得研发有效的泛 LASV 疫苗变得异常复杂。
为了解决这些难题，科研人员们不断探索。终于，他们在《NPJ Vaccines》期刊上发表了一篇名为《A rationally designed prefusion - stabilized Lassa virus glycoprotein trimer antigen elicits neutralizing antibodies》的论文。在这篇论文中，他们设计并生产了一种名为 GPCv2 的 LASV 预融合 GPC 三聚体抗原，发现这种抗原能诱导更高水平的中和抗体，还能保护小鼠免受 LASV 假病毒的攻击，为拉沙病毒疫苗的研发带来了新的曙光。
为了开展这项研究，科研人员们运用了多种技术方法。他们通过结构分析，基于 LASV GPC 的晶体结构，对 GPC 进行了改造设计；利用蛋白质表达与纯化技术，在 Expi293F 细胞中表达并纯化出 GPCv1 和 GPCv2；借助多种检测技术，如 ELISA、SPR、质谱分析等，对 GPCv2 的结构、抗原性、免疫原性等进行全面检测；还使用了动物实验技术，用 GPCv2 免疫小鼠，观察免疫效果，并进行假病毒攻击实验，评估疫苗的保护能力；最后通过 BCR 测序技术，分析免疫小鼠的 BCR CDR3 序列，探究疫苗对免疫反应的影响 。
下面来看看他们具体都有哪些重要的研究成果吧。
重组预融合稳定三聚体抗原的合理设计
科研人员以 LASV GPC（约西亚株）的胞外域序列为基础，参考预融合 GPC 的晶体结构（PDB：5VK2 和 7PUY），开始了一场 “改造之旅”。他们首先把 S1P 切割位点 “RRLL” 换成 G4S 接头，这样可以提高稳定性，避免 GP1 和 GP2 分离。接着，在 326 - 333 的转角区域的 328 位引入脯氨酸，这一招在设计 SARS - Cov 2 Spike、HIV Env 等抗原时都很有效，能防止局部不稳定区域从预融合状态转变为融合后状态，阻碍 GP2 内部的重折叠过程。经过这些改造的构建体被命名为 GPCv1，在 Expi293F 细胞中表达并纯化后，能得到一定量的预融合蛋白。为了让 GPC 更像病毒的天然膜结构，他们又在 GP2 的 C 末端添加了三聚化基序，得到了 GPCv2。通过 HPLC 分析和 SDS - PAGE 检测发现，GPCv2 比 GPCv1 有更多的三聚体亚基。而且，GPCv2 和之前描述的 GPC 在聚糖组成上高度相似，但在糖基化修饰上有些差异，这些差异可能会影响蛋白质表面的表位，进而影响免疫系统产生中和反应的能力。
预融合稳定的三聚体 GPCv2 展现出更多类似天然 GPC - B 的表位
研究发现，针对 GPC 的 NAbs 可以分成四个交叉竞争组，分别是 GPC - A、GPC - B、GPC - C 和 GP1 - A。为了验证稳定后的 LASV GPC 三聚体的预融合构象，探究 GPCv2 的抗原性，科研人员进行了 ELISA 和基于表面等离子共振（SPR）的结合实验。他们把一组 NAbs 固定，然后检测等摩尔量的 GPCv2 与它们的结合情况。结果发现，除了 GPC - C 抗体 8.9F，其他抗体都能和 GPCv2 结合，说明稳定后的三聚体抗原性和天然的比较相似。而且，GPCv2 与 GPC - B 组 NAbs（37.7H 和 37.2D）的结合能力明显增强，比单体 GPCv1 表现更好，这意味着 GPCv2 能更好地模拟天然 GPC 三聚体的底部界面、GP1 跨度以及 GP2 和 GP1 的表面结构。
GPCv2 能有效诱导中和抗体
科研人员用 GPCv2 在小鼠身上进行免疫研究，来评估它的免疫原性。通过 ELISA 分析发现，第一次免疫后，GPCv2 诱导产生的抗 GPC IgG 滴度就比 GPCv1 高很多。第二次免疫后，这种差异依然存在，虽然第三次免疫后两者的抗 GPC 滴度变得相似，但有意思的是，接种 GPCv2 的小鼠在免疫后 28 天，抗 GP1 抗体滴度整体更高。这可是个意外之喜，因为 GP1 和病毒与宿主细胞受体的结合有关，也许 GPCv2 在对抗 GP1 相关疾病方面有潜在的应用价值呢。
接着，科研人员用基于慢病毒的假病毒实验来检测 NAb 反应。三次免疫后，GPCv2 组的小鼠都成功产生了 NAb 滴度，而且直到免疫后 120 天，这些滴度还维持在较高水平。相比之下，PBS 组和 GPCv1 组在产生 NAbs 方面就困难重重。科研人员还使用了一种重组沙粒病毒模型 rLCMV/LASV GPC 进一步验证，发现免疫后 42 天，GPCv2 诱导的血清中和抗体比 PBS 对照组和 GPCv1 免疫组都要强得多。
科研人员还测试了免疫血清与已知 GPC 特异性人单克隆抗体竞争结合 GPC 的能力，发现免疫血清和 37.7H、37.2D、12.1F 等单克隆抗体都有竞争作用，其中 37.7H 的结合抑制百分比最高。此外，通过 ELISpot 和细胞内细胞因子染色（ICS）实验发现，接种 GPCv1 或 GPCv2 的小鼠，其脾细胞对 GL - 9 肽的反应很强，产生 IFN - γ 的 CD4 细胞数量明显增加，说明疫苗能有效激活 T 细胞。
GPCv2 疫苗能保护小鼠免受 LASV 假病毒攻击
为了看看 GPCv2 到底有没有保护作用，科研人员进行了 LASV 假病毒攻击实验。他们给 10 周大的 BALB/c 小鼠分别接种 GPCv1、GPCv2（都添加了 CpG 和明矾佐剂），对照组则接种 PBS。五周后，用携带荧光素酶报告基因的 HIV - backbone 假病毒对小鼠进行腹腔注射攻击。因为假病毒进入细胞后会表达荧光素酶，在合适的底物存在下会产生生物发光现象，所以通过检测发光强度就能知道假病毒的感染情况和疫苗的保护效果。
实验结果令人惊喜，从攻击后第 5 天开始，GPCv2 免疫组小鼠的荧光值就明显低于其他两组。GPCv1 组小鼠的生物发光强度也有所降低，但不如 GPCv2 组明显，这说明 GPCv1 疫苗也有一定的保护作用，不过 GPCv2 的保护效果更胜一筹，几乎能完全保护小鼠。
免疫导致具有不同特征的 BCR 库
B 细胞受体（BCR）的多样性决定了 B 细胞能识别哪些抗原，为了深入了解 GPCv2 诱导的抗体的功能特异性，科研人员对免疫小鼠的 BCR CDR3 序列进行了分析。他们给 BALB/c 小鼠接种 GPCv1 或 GPCv2 后，收集脾脏进行 BCR 高通量测序。结果发现，GPCv2 和 GPCv1 免疫组之间的克隆交流程度比它们和对照组之间高很多，这意味着面对相似的抗原表位时，免疫系统会激活特定的 B 细胞亚群，产生相似的 BCR 克隆型。
进一步分析发现，GPCv1 免疫小鼠最常使用的 V - J 基因对是 IGHV2 - 602: IGHJ401，而 GPCv2 免疫小鼠则是 IGHV1S3001: IGHJ201，GPCv2 组独特的 IGHV 前体频率更高，这可能和它更强的中和反应有关。不过，虽然两组的克隆型和 VJ 配对偏好差异明显，但在体细胞高频突变（SHM）频率上，整体并没有显著差异。
综合这些研究成果，科研人员通过合理设计，成功让 GPC 保持在预融合三聚体构象，生产出的 GPCv2 蛋白能和多种 NAbs 高亲和力结合。接种 GPCv2 疫苗后，小鼠产生了强烈的抗 GPC 抗体反应，尤其是 NAb 反应能持续到免疫后 120 天，而且还对 HIV - backbone 假病毒攻击有保护作用。BCR 测序也揭示了一些和疫苗效果相关的 V - J 基因对，为进一步改进疫苗提供了方向。
不过，这项研究也存在一些不足。目前还没有用真正的病毒进行攻击实验，所以无法全面评估疫苗的效果。而且疫苗的性能还有提升空间，可能需要更多的稳定策略。未来，科研人员还需要深入研究预融合稳定的 GPC 疫苗诱导保护的机制，比如研究疫苗和免疫系统的相互作用、免疫反应的持续时间和质量，以及长期保护的潜力。此外，探索不同疫苗平台的联合使用，利用人工智能辅助抗原设计，或许能让拉沙病毒疫苗的研发取得更大的突破。
尽管如此，这项研究仍然意义重大。它为拉沙病毒疫苗的研发提供了新的思路和重要依据，让我们在对抗拉沙病毒的道路上又前进了一步。相信在科研人员的不断努力下，终有一天能研发出有效的拉沙病毒疫苗，保护人们免受这种危险病毒的侵害。
