揭秘牙髓炎疼痛 “幕后黑手”：小胶质细胞 P2X7R 调控外泌体 “作祟”

为探究牙髓炎疼痛机制，第四军医大学的研究人员开展了小胶质细胞 P2X7R 与外泌体在牙髓炎疼痛中作用的研究。结果发现二者调控 IL-1β 分泌影响疼痛，该成果为牙髓炎治疗提供新思路，值得科研读者一读。

　　

在我们的口腔里，有一种让人疼得直打滚的疾病 —— 牙髓炎（Pulpitis），它可是口腔疾病界的 “狠角色”，主要由严重龋齿引发，患者会感受到剧烈的颌面疼痛。牙髓炎初期要是没及时干预，就会发展成不可逆的牙髓炎，不仅折磨患者，还会引发牙科焦虑，严重影响生活质量。然而，这么厉害的 “对手”，它引发疼痛的具体机制却一直藏在 “迷雾” 里，这可让医生们头疼不已，所以弄清楚这个机制就显得格外重要。

之前的研究发现，牙髓炎会降低神经纤维末梢的疼痛阈值，激活牙髓伤害感受器，进而促进髓质背角（MDH，Medullary Dorsal Horn）的中枢敏化。而且，MDH 中的小胶质细胞激活在牙髓炎相关的中枢敏化机制里起着关键作用。小胶质细胞表面有一种叫 P2X7 受体（P2X7R，P2X7 Receptor）的 “小开关”，它是 ATP 门控阳离子通道，在炎症和疼痛发展中意义重大，阻断它能降低伤害性神经元的中枢敏化。咱们研究团队之前还发现，MDH 中的小胶质细胞 P2X7R 会促进 IL-1β 释放，导致牙髓炎疼痛。但 P2X7R 和外泌体（Exosomes，一种直径 40 - 100nm 的膜泡，能在细胞间传递信号，参与多种疾病过程）在牙髓炎疼痛中的关系，还没人研究过。外泌体在很多疾病里都可能是潜在的生物标志物，还参与炎症和神经性疼痛，可它在牙髓炎疼痛里扮演什么角色，同样是个未知数。

为了揭开这些谜团，第四军医大学的研究人员在《Journal of Cellular and Molecular Medicine》期刊上发表了一篇名为 “Microglial P2X7 receptor‐regulated exosome secretion contributes to pulpitis‐induced pain” 的论文。研究发现，外泌体有望成为牙髓炎疼痛的新型潜在生物标志物。牙髓炎发作后，外泌体中 IL-1β 分泌增加，这是持续疼痛的关键，而这个过程由 MDH 中的小胶质细胞 P2X7R 调控。这一发现揭示了牙髓炎疼痛的新机制，还为治疗提供了新思路，要是能抑制 P2X7R，说不定就能缓解牙髓炎疼痛啦。

研究人员为了开展这项研究，用了不少厉害的技术方法。他们先建立了实验性牙髓炎大鼠模型，然后通过行为学评估来观察大鼠的疼痛反应。还运用免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）这些技术，分析相关蛋白和基因的表达情况。另外，他们用差速离心法分离外泌体，再用透射电子显微镜（TEM）、纳米流式分析仪等对其进行鉴定和分析。

下面咱们来详细看看研究结果。

1. 大鼠实验性牙髓炎模型的机械性痛觉过敏：研究人员给大鼠建立了实验性牙髓炎模型，通过用 von Frey 细丝刺激大鼠左脸脸颊，观察疼痛阈值的变化。结果发现，模型组大鼠的疼痛阈值比对照组低很多，而且随着牙髓暴露时间延长，疼痛阈值越来越低，到第 7 天降到最低。这说明实验性牙髓炎模型成功建立，而且牙髓炎引起的机械性痛觉过敏和时间有关，就好像疼痛在第 7 天 “憋足了劲”，变得最厉害。

2. 牙髓炎大鼠 MDH 中外泌体和 IL-1β 的分泌增强：研究人员在不同时间点收集大鼠 MDH 组织，检测外泌体分泌的代表性蛋白 Rab27a 的表达。免疫荧光染色和 Western blot 分析都显示，牙髓暴露后 Rab27a 表达显著增加，和暴露时间有关，第 7 天表达最高。而且，Rab27a 表达增加和疼痛阈值呈负相关。qRT-PCR 检测发现，牙髓炎诱导后，MDH 中外泌体和炎症因子 IL-1β 的分泌都增加，趋势相似。这就表明，牙髓暴露后 Rab27a 和炎症因子表达增加，和牙髓炎疼痛的严重程度正相关，外泌体分泌增加和炎症加剧有关，会导致持续疼痛。

3. GW4869 缓解牙髓炎疼痛并抑制炎症反应：为了看看外泌体在牙髓炎疼痛调节里的作用，研究人员用外泌体抑制剂 GW4869 进行立体定向注射实验。他们先注射荧光金染料确认注射位置准确，然后观察发现，和注射 DMSO 的对照组相比，注射 GW4869 的大鼠疼痛阈值升高，疼痛缓解，在注射 24 小时后效果最明显。这说明抑制外泌体分泌能阻断疼痛信号传递，抑制炎症反应，减轻疼痛。另外，Western blot 检测发现，GW4869 能下调 Rab27a 和 IL-1β 的表达，双免疫荧光染色也显示，GW4869 能显著抑制小胶质细胞 Rab27a 的表达。

4. P2X7R 拮抗剂 BBG 在体内下调 Rab27a 和 IL-1β：P2X7R 主要存在于中枢神经系统的小胶质细胞里，研究人员用 P2X7R 拮抗剂 BBG 进行实验，看看 P2X7R 在实验性牙髓炎模型里对小胶质细胞 Rab27a 表达和 IL-1β 分泌有没有调节作用。结果发现，给大鼠注射 BBG 后，体内 P2X7R 和 Rab27a 表达都降低，说明外泌体分泌减少。Western blot 和免疫荧光染色结果一致，而且 P2X7R 被阻断后，促炎细胞因子 IL-1β 的水平也降低了。这表明外泌体和炎症因子 IL-1β 的分泌变化和 P2X7R 表达有关。

5. GW4869 和 oxATP 在体外抑制小胶质细胞外泌体分泌：为了进一步确认 P2X7R 在炎症环境中外泌体分泌的作用，研究人员在体外培养小胶质细胞，然后用超速离心法提取外泌体。TEM 观察到外泌体是双层膜结构，呈杯状。Western blot 检测发现，用 1μM LPS 刺激后，外泌体特异性蛋白 CD63 和 CD81 表达，而且 IL-1β 和 P2X7R 也在 LPS 刺激的外泌体里被检测到，这和之前的研究结果相符，说明 P2X7R 激活的小胶质细胞释放 IL-1β 主要通过外泌体介导。纳米流式分析显示，得到的外泌体直径在 40 - 160nm，符合典型外泌体特征，而且不同组的外泌体平均大小差不多。研究还发现，和对照组相比，LPS 刺激会增加小胶质细胞外泌体分泌，而 GW4869 和 oxATP 处理会抑制分泌，其中 oxATP 的抑制作用特别明显。

6. 抑制小胶质细胞外泌体分泌减少炎症因子 IL-1β 的释放：在实验性牙髓炎模型里，给大鼠注射 GW4869 能缓解疼痛，抑制小胶质细胞 Rab27a 表达。为了在体外验证这个结果，研究人员用了三种实验方法。免疫荧光染色发现，LPS 会增加 Rab27a 表达，而外泌体抑制剂 GW4869 能逆转这个效果。Western blot 和 qRT-PCR 检测也发现，LPS 处理后 Rab27a 和 IL-1β 的蛋白和 mRNA 水平都显著增加，而 GW4869 能抑制这种增加，这表明抑制外泌体分泌会影响炎症环境中 IL-1β 的释放。

7. LPS 通过 P2X7R 促进小胶质细胞外泌体分泌：LPS 刺激会激活小胶质细胞，同时 P2X7R 表达增加，而用 P2X7 拮抗剂 oxATP 处理能有效抑制 P2X7R 的上调。为了确认 P2X7R 和小胶质细胞外泌体的关系，研究人员给 LPS 刺激的小胶质细胞用 oxATP 处理。qRT-PCR 结果显示，和对照组相比，LPS 刺激会增加 P2X7R、Rab27a 和 IL-1β 的 mRNA 水平，而 oxATP 对 Rab27a 和 IL-1β 的分泌有相反的作用。这说明 P2X7R 激活在炎症驱动的小胶质细胞外泌体分泌里起关键作用。

综合研究结果和讨论部分来看，这项研究意义重大。牙髓炎是常见的口腔疾病，会引发颌面疼痛，严重影响患者生活，所以找到新的疼痛相关生物标志物和治疗靶点很关键。研究人员通过建立大鼠牙髓炎模型，用各种技术方法研究发现，外泌体在 MDH 里可能是牙髓炎疼痛的关键标志物，IL-1β 通过小胶质细胞 P2X7R 调节从外泌体释放。GW4869 和 BBG 都能通过抑制外泌体分泌和相关炎症因子表达来缓解疼痛，这表明小胶质细胞 P2X7R 介导的外泌体分泌可能是牙髓炎疼痛的新机制。虽然研究还有一些局限性，比如体外实验不能观察疼痛行为，用 LPS 模拟牙髓炎炎症不够全面，但这些发现还是为牙髓炎疼痛的研究开辟了新方向。以后要是对这些外泌体进行更深入的蛋白质组学、脂质组学和转录组学分析，说不定能进一步揭示它们在炎症过程中的作用机制，为治疗牙髓炎疼痛提供更有效的方法。