编辑推荐：
为解决 Pirtobrutinib 缺乏血浆定量方法及药代动力学数据空白问题，北京友谊医院等单位研究人员开展相关研究。建立了 UHPLC-MS/MS 测定法并用于大鼠药代动力学研究。该成果为 BTK 抑制剂研究提供参考，值得科研人员一读。
在癌症治疗领域，Bruton 酪氨酸激酶（BTK）抑制剂可谓是一颗闪耀的 “明星” ，它在套细胞淋巴瘤（MCL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）以及小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）等疾病的治疗中发挥着至关重要的作用。BTK 作为一种关键的非受体酪氨酸激酶，在 B 细胞（B 淋巴细胞，参与人体免疫反应的一类重要细胞）的增殖、成熟、分化、凋亡和迁移过程中扮演着 “指挥官” 的角色。当 B 细胞受体（BCR）信号通路被激活时，BTK 就像被按下了启动按钮，积极推动肿瘤细胞存活和增殖。而 BTK 抑制剂的出现，就像是给 BTK 这台 “疯狂运转的机器” 踩下了刹车，它能特异性地阻断 BTK 的激活，阻碍 BCR 信号传导，进而诱导肿瘤细胞走向凋亡，成为治疗 B 细胞恶性肿瘤的有力武器。
随着医学的不断进步，BTK 抑制剂逐渐取代了传统化疗，凭借着良好的选择性和较低的不良反应，为患者带来了新的希望。但早期的 BTK 抑制剂也存在着一些令人头疼的问题。它们就像 “强力胶水” 一样，与 BTK 共价且不可逆地结合，这使得在治疗 CLL 时，很难实现微小残留病阴性，还会引发患者不耐受和耐药等情况，就像给治疗之路设置了重重障碍。
就在大家为这些问题发愁的时候，第三代 BTK 抑制剂闪亮登场，其中就有 Pirtobrutinib。它是首个获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的非共价、可逆性 BTK 抑制剂，专门用于治疗经过至少两种先前治疗方案（包括 BTK 抑制剂和 B 细胞淋巴瘤 - 2（BCL - 2）抑制剂治疗）的 CLL/SLL 患者。Pirtobrutinib 就像一个 “智能战士”，在体外对野生型和 C481 突变型 BTK 都能展现出高度选择性的抑制效果，而且效力强劲，还能抑制所有突变型 BTK（如 C481S、C481T、C481R）中 Y223 的自磷酸化。在相关临床试验中，它的表现也十分出色，安全性高，疗效显著，给那些对之前共价 BTK 抑制剂治疗产生耐药或不耐受的患者带来了新的曙光。
然而，Pirtobrutinib 也有自己的 “小缺点”，它虽然在体外具有高渗透性，但水溶性较差。为了解决这个问题，科研人员研发出了喷雾干燥分散片剂型，确保了稳定的口服生物利用度。尽管如此，一个新的难题又摆在了大家面前：目前还没有一种成熟的超高效液相色谱串联质谱（UHPLC - MS/MS）方法来测定 Pirtobrutinib，其药代动力学相关数据也尚未见报道。考虑到这种新一代抗癌药物在临床应用上的紧迫性，以及在血浆中精准定量以监测治疗浓度的需求，来自北京友谊医院等单位的研究人员决心攻克这个难题。他们的研究成果发表在了《Journal of Pharmaceutical Analysis》期刊上，论文题目是《Development and validation of an ultra - high - performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of pirtobrutinib in rat plasma and its application to a pharmacokinetic study》。这项研究成功建立了一种灵敏且稳定的基于 UHPLC - MS/MS 测定 Pirtobrutinib 的方法，并将其应用于大鼠的药代动力学研究，为后续研究提供了宝贵的数据支持，意义重大。
研究人员为了开展这项研究，主要用到了以下几个关键技术方法：
首先是超高效液相色谱串联质谱（UHPLC - MS/MS）技术，这可是整个研究的 “得力助手”。通过它可以对化合物进行定量分析，其分离优化和参数选择对研究结果的准确性和灵敏度起着决定性作用。研究人员精心挑选了 SHIMADZU Shim - pack GIST C18 色谱柱，并对流动相、梯度洗脱程序、柱温和进样量等进行了优化。在质谱检测方面，采用正离子模式多反应监测（MRM），精准选择了特定的离子跃迁进行检测。
其次，为了确保检测的准确性，研究人员制备了校准溶液和质量控制（QC）样品。通过一系列严谨的稀释操作，得到不同浓度的校准标准样品和 QC 样品，用于构建标准曲线和评估方法的性能。
另外，在样品处理上，研究人员采用了蛋白沉淀法。这种方法可以有效地提取血浆中的 Pirtobrutinib，去除干扰物质，为后续的检测做好准备。
下面来看看研究的具体结果：
方法开发
在方法开发阶段，研究人员就像一群 “精密的工匠”，对各个环节进行了精心打磨。在色谱分离条件的选择上，他们尝试了不同的色谱柱，最终发现 SHIMADZU Shim - pack GIST C18 柱（2.1mm×100mm，2μm）表现最为出色，能让分析物的峰形和分离效果达到最佳。对于流动相，经过比较甲醇和乙腈，发现乙腈可以加速 Pirtobrutinib 从色谱柱中洗脱出来。在选择内标时，由于稳定同位素标记的内标难以获取，研究人员巧妙地选用了另一种 BTK 抑制剂类似物 Zanubrutinib。它与 Pirtobrutinib 在色谱行为上相似，完全满足方法验证在特异性、基质效应和回收率等方面的要求。在质谱参数优化方面，研究人员通过对 Pirtobrutinib 在 ESI 正离子模式下的质谱行为进行深入研究，选择了 m/z 480.12→294.05 和 472.20→289.96 作为 Pirtobrutinib 和内标的离子跃迁，同时仔细优化了碰撞电压。在样品预处理过程中，研究人员对不同的蛋白沉淀剂进行了比较，最终确定冷甲醇是最佳选择，它既能有效提取 Pirtobrutinib，又能去除血浆中的干扰物质，保证了基质效应和回收率符合标准。
方法验证
经过一系列精心开发，接下来就要对这个方法进行全面的 “体检”，看看它是否真的可靠。
- 特异性和灵敏度：从色谱图上可以清晰地看到，Pirtobrutinib 和内标的保留时间分别为 2.26min 和 2.25min。在检测不同大鼠的空白血浆时，没有发现内源性物质产生的干扰峰，这就像在一片清澈的湖水中没有泛起一丝涟漪，证明了该方法的特异性和灵敏度完全符合生物分析方法验证指南的要求。
- 校准和定量下限：Pirtobrutinib 在大鼠血浆中的浓度与对应的峰面积之间呈现出良好的线性关系，就像一条笔直的高速公路。通过计算得到的校准曲线线性回归方程为 Y = 0.0305X + 0.00279（r2 = 0.999），定量下限（LLOQ）低至 0.5ng/ml，而且在这个浓度下，Pirtobrutinib 的信噪比（S/N）远远高于 10，精度和准确度也都符合要求，这表明该方法在低浓度检测时也能保持精准。
- 准确度和精密度：研究人员通过测试不同浓度（1.0、25 和 400ng/mL）的 QC 样品来评估 Pirtobrutinib 测定的准确度和精密度。结果令人满意，日内和日间的准确度和精密度都在 ±10.3% 以内，这意味着无论何时进行检测，该方法都能给出稳定可靠的结果。
- 回收率和基质效应：采用简单的蛋白沉淀法进行血浆提取后，研究人员发现 Pirtobrutinib 的平均回收率在 91.7 - 100.4% 之间，基质效应在 95.1 - 101.5% 之间，且两者的相对标准偏差（RSD%）都在可接受范围内。这说明这种提取方法就像一个高效的 “过滤器”，既能有效地提取目标物质，又不会对检测结果产生太大的干扰。
- 稳定性：为了考察 Pirtobrutinib 在不同条件下的稳定性，研究人员模拟了多种储存和处理条件，包括室温放置 4 小时、在自动进样器中 4°C 保存、经历三次冻融循环（-80°C 到室温）以及在 - 80°C 长期储存一个月。结果显示，在这些条件下，Pirtobrutinib 都表现得十分 “稳定”，RSD% 值小于 9.8%，RE% 值小于 ±11.7%，完全符合 ±15% 的稳定性标准。
- 稀释完整性：在评估稀释完整性时，研究人员设置了浓度为 800ng/mL 的稀释 QC 样品，稀释因子为 2。经过分析发现，6 次重复实验的平均准确度为 1.67%，变异系数（% CV）为 2.95，都在指南规定的可接受范围内，进一步证明了该方法的可靠性。
药代动力学研究和样品再分析（ISR）
研究人员成功地将开发的 UHPLC - MS/MS 方法应用于大鼠的药代动力学研究。给大鼠灌胃 10mg?kg?1 的 Pirtobrutinib 后，通过检测不同时间点的血浆浓度，绘制出了平均血浆浓度 - 时间曲线。结果发现，Pirtobrutinib 在大鼠体内吸收迅速，就像一个短跑健将，在 1.08±0.736h 就达到了峰值浓度（Cmax），为 344±56.6ng/ml，消除半衰期（t1/2）为 2.95±0.121h。到了最后一个采样时间点（48h），由于代谢迅速，Pirtobrutinib 的浓度已经低于定量下限。在对 12 个来自峰浓度（Cmax）附近和消除相时间点的实际血浆样品进行再分析时，发现重复值与初始值之间的差异小于 20%，这表明 ISR 符合验收标准。
在研究结论和讨论部分，研究人员成功建立并验证了一种用于定量测定大鼠血浆中 Pirtobrutinib 的超高效液相色谱串联质谱（UHPLC - MS/MS）方法，这是一项具有开创性的工作。此前，还没有研究对血浆中 Pirtobrutinib 的浓度进行过定量分析，而这项研究填补了这一空白，并成功应用于大鼠的药代动力学研究。不过，研究人员也清楚地认识到，由于物种差异，大鼠的药代动力学数据并不能完全代表 Pirtobrutinib 在人体内的行为，还需要进一步开展人体研究。但无论如何，这项研究为 Pirtobrutinib 以及其他 BTK 抑制剂的临床前和临床研究提供了宝贵的参考依据，就像为后续的研究点亮了一盏明灯，指引着科研人员继续探索 BTK 抑制剂在癌症治疗领域的无限潜力，为更多患者带来治愈的希望。
