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为解决细菌防御系统限制噬菌体疗法的问题，作者[第一作者单位] 研究人员以 Tmn 防御系统为模型开展噬菌体改造研究。他们成功改造噬菌体突破 Tmn 防御，这为噬菌体疗法发展提供新思路，强烈推荐科研读者阅读。
在现代医学领域，抗生素曾是对抗细菌感染的 “神药”，可随着人们对抗生素的过度使用，细菌们也开始 “奋起反抗”，耐药细菌不断出现，这就像是一群变得刀枪不入的 “小怪兽”，给全球公共卫生带来了巨大的威胁。面对这些耐药细菌，科学家们开始寻找新的 “秘密武器”，其中，噬菌体疗法（利用噬菌体来对抗细菌感染的治疗方法）成为了备受瞩目的潜力选手。
噬菌体，简单来说就是专门 “吃” 细菌的病毒，它有着独特的杀菌机制，能够精准地找到并消灭那些让抗生素束手无策的耐药细菌。可理想很丰满，现实却很骨感，噬菌体疗法在推广的道路上困难重重。其中最大的阻碍就是细菌自身拥有一套又一套的防御机制，就像给细菌穿上了一层又一层的 “铠甲”，让噬菌体难以突破防线去发挥作用。比如说，细菌会改变或者直接丢掉噬菌体进入细胞所需要的受体，让噬菌体找不到 “入口”；它们还会利用像 CRISPR-Cas 和限制修饰系统这样的防御系统，来阻止噬菌体的入侵。据研究发现，超过 78% 的细菌都拥有两种或更多的防御系统，这无疑给噬菌体疗法的发展增添了巨大的难度。
为了攻克这些难题，让噬菌体疗法能够真正发挥作用，来自 作者[第一作者单位] 的研究人员展开了深入的探索。他们的研究成果发表在了《期刊原文名称》上，论文的题目是《论文原文标题》。在这项研究中，研究人员以 Tmn 防御系统为模型，成功找到了两种改造噬菌体的方法，让噬菌体能够突破细菌的防御，这一成果为噬菌体疗法的发展带来了新的希望。
研究人员在开展研究时，用到了几个关键的技术方法。首先是基因编辑技术，通过对噬菌体基因进行编辑，比如删除或替换特定基因，来研究其对噬菌体感染能力的影响。其次是基因组测序技术，利用该技术分析噬菌体基因组的变化，找出与逃避细菌防御相关的基因变异。另外，斑点试验（spot assay）也是重要的研究手段，通过这个试验可以直观地观察噬菌体对细菌的感染情况 。
下面来看看研究人员具体都有哪些重要的发现。
鉴定抗 Tmn 蛋白
研究人员在之前的研究中发现，属于 Dhillonvirus 属的噬菌体 ΦSMS22 和 ΦSMA8 面对 Tmn 防御系统时，表现出了截然不同的 “命运”。ΦSMS22 能够成功躲避 Tmn 的防御，而 ΦSMA8 则会被 Tmn 抑制，最终落得个 “破裂而亡” 的下场。这让研究人员猜测，ΦSMS22 要么是缺少能触发 Tmn 防御的基因，要么就是拥有特殊的基因帮助它逃脱 Tmn 的 “追捕”。
为了一探究竟，研究人员决定对 ΦSMS22 进行 “解剖”。他们敲除了 ΦSMS22 中一个名为 ORF35 的基因，这个基因在 ΦSMA8 中是不存在的。结果发现，敲除 ORF35 基因后，ΦSMS22 对表达 Tmn 的大肠杆菌的感染能力明显下降，这就表明 ORF35 基因很可能就是对抗 Tmn 的 “秘密武器”，也就是抗 Tmn 蛋白的编码基因。
研究人员还利用 AlphaFold 预测了抗 Tmn 蛋白的结构，发现它呈现出一种独特的杆状结构，就像一根小小的 “金箍棒”。而且，这个蛋白的二聚体比单体更稳定。随后，研究人员在 GenBank 数据库中对所有噬菌体和古细菌病毒蛋白进行搜索，发现抗 Tmn 蛋白的同源物大多存在于 Dhillonvirus 属中，这说明抗 Tmn 蛋白是一个存在于特定病毒谱系中的特殊系统。
研究人员还在自己的噬菌体库中寻找含有抗 Tmn 同源物的噬菌体，找到了 5 种，可奇怪的是，这 5 种噬菌体依然会受到 Tmn 的抑制。于是，他们把这 6 种噬菌体（包括 ΦSMS22）的抗 Tmn 同源物克隆到质粒上，然后在大肠杆菌中与 Tmn 共同表达，再用 7 种噬菌体去感染这些细菌。结果发现，只有来自 ΦSMS22 的抗 Tmn 蛋白能够让那些被 Tmn 抑制的噬菌体重新获得感染能力。这表明，抗 Tmn 蛋白的氨基酸序列哪怕只有一点点差异，都会影响它对抗 Tmn 的效果。
研究人员还想知道抗 Tmn 蛋白是不是只能对抗一种 Tmn 系统。他们从细菌 RefSeq 数据库中找出了 397 个 Tmn 蛋白，经过筛选得到了 81 个非冗余的 Tmn 同源物。然后，他们从临床分离株中克隆了 4 种 Tmn 变体，把它们和抗 Tmn 蛋白一起在大肠杆菌中表达，再用噬菌体去感染。结果发现，不同的抗 Tmn 蛋白对不同的 Tmn 变体有不同的抑制效果，这进一步证明了抗 Tmn 蛋白具有特异性，能针对不同的 Tmn 系统发挥作用。
利用抗 Tmn 合成逃避 Tmn 防御系统的噬菌体
既然找到了效果最好的抗 Tmn 蛋白，研究人员就想着利用它来改造噬菌体，让噬菌体能够成功突破 Tmn 的防御。他们选择了 ΦKSS9 噬菌体，因为它虽然也有抗 Tmn 同源物，但却无法抵抗 Tmn 的防御。研究人员通过体外组装技术，把 ΦKSS9 中的抗 Tmn 基因替换成了 ΦSMS22 中的抗 Tmn 基因，成功得到了改造后的噬菌体 ΦKSS9anti-Tmn。
经过测试，野生型的 ΦKSS9 很容易受到 Tmn 免疫的影响，而改造后的 ΦKSS9anti-Tmn 则表现出了对 Tmn 免疫的抗性。在液体培养实验中，接种了 ΦKSS9 的 Tmn 表达菌株生长情况和未接种噬菌体的菌株差不多，这说明 ΦKSS9 在液体环境中无法突破 Tmn 的防御；而接种了 ΦKSS9anti-Tmn 的 Tmn 表达菌株，其生长则迅速受到抑制。这一系列实验表明，通过给噬菌体引入免疫逃避蛋白，能够让噬菌体绕过细菌的防御系统，成功感染细菌。
分离逃避 Tmn 免疫的噬菌体
除了引入抗 Tmn 蛋白，研究人员还想尝试通过基因突变的方法来获得能够逃避 Tmn 防御的噬菌体。他们知道，当噬菌体的基因组发生自发突变时，就有可能逃避细菌防御系统的检测。于是，他们把对 Tmn 敏感的噬菌体 ΦSMA8 和 ΦSMS22Δanti-Tmn，与表达 Tmn 的细菌一起培养，希望能筛选出逃脱 Tmn 防御的噬菌体。
经过努力，他们成功得到了两种逃脱的噬菌体，分别命名为 SMA8_em 和 SMS22Δant-Tmn_em。对这两种噬菌体进行全基因组序列分析后发现，它们都发生了 3 个突变，而且都有一个共同的突变发生在编码 DNA 修饰酶 nmad5 的基因上，只是突变位点不同，但相对位置是等效的。为了确定到底是哪个突变基因导致了噬菌体能够逃避 Tmn 免疫，研究人员把 ΦSMS22Δanti-Tmn_em 中的突变基因一个一个地反向突变回原来的序列，然后进行噬菌斑实验。结果发现，只有把 nmad5 基因恢复到原来的序列时，噬菌体才会重新对 Tmn 免疫敏感，这就表明 nmad5 基因在噬菌体逃避 Tmn 防御的过程中起着关键作用。虽然研究人员尝试克隆 nmad5 基因时遇到了困难，发现它似乎有毒性，而且删除 nmad5 基因也不能让噬菌体逃避 Tmn 的抑制，但这些结果还是说明，噬菌体可以通过在 nmad5 基因上获得一个错义突变，从而获得逃避 Tmn 防御系统的能力。
利用 nmad5 突变合成逃避 Tmn 防御系统的噬菌体
既然 nmad5 基因这么关键，研究人员就尝试通过在 nmad5 基因上引入突变，来构建能够逃避 Tmn 检测的噬菌体。他们通过体外组装技术，在 ΦSMS22Δanti-Tmn_1 的 nmad5 基因中引入了 K296E 突变，得到了噬菌体 ΦSMS22Δanti-Tmn_1_Nmad5K296E。
实验结果显示，ΦSMS22Δanti-Tmn 对 Tmn 免疫敏感，而 ΦSMS22Δanti-Tmn_1_Nmad5K296E 则对 Tmn 防御表现出很强的抗性。在液体培养实验中，ΦSMS22Δanti-Tmn_1_Nmad5K296E 能够迅速抑制 Tmn 表达菌株的生长，而 ΦSMS22Δanti-Tmn 则不能。这表明，在 Dhillonvirus 属噬菌体的 nmad5 基因中引入突变，是一种可行的克服 Tmn 防御系统的策略。
总的来说，这项研究通过两种不同的策略，成功改造出了能够克服 Tmn 防御系统的合成噬菌体。第一种策略是引入抗 Tmn 基因，第二种策略是在与噬菌体检测相关的 nmad5 基因上引入突变。这两种方法各有优缺点，比如寻找抗防御基因可能会比较耗时，但一旦找到，将其整合到噬菌体基因组中就能有效克服特定的防御系统；而通过基因突变来逃避防御系统虽然相对省时省力，但可能会影响噬菌体的其他功能。
这项研究的意义重大，它为噬菌体疗法的发展提供了新的思路和方法。以前，在噬菌体疗法中，找到能针对目标细菌的噬菌体既耗时又费力，因为细菌的防御系统太多变了。而现在，研究人员通过这两种策略，展示了一种更合理、更快速的匹配噬菌体和目标细菌的方法，有望在未来推动噬菌体疗法的广泛应用，帮助人类更好地对抗耐药细菌的威胁，为全球公共卫生事业带来新的曙光。
