颠覆传统！无 5′帽 mRNA 载体成功逆袭，为流感疫苗研发带来新曙光

为解决 mRNA 疫苗生产中 5′帽相关成本及稳定性问题，美国南阿拉巴马大学研究人员开展无 5′帽 mRNA 载体研究。结果显示该载体可表达 HA 并保护小鼠。此研究为 mRNA 疫苗研发开辟新方向，推荐科研读者阅读。

　　

在当今的医学研究领域，mRNA 疫苗可谓是明星般的存在。自 mRNA 疫苗在控制新冠疫情中大放异彩后，它的有效性得到了充分验证，也为后续的疫苗设计提供了宝贵的思路。mRNA 疫苗凭借其非整合性和短暂表达的特性，成为了疫苗研发的热门方向。它不仅能诱导体液免疫和细胞介导免疫，而且生产过程相对简单，成本较低，还能快速响应新兴的传染病威胁。

然而，mRNA 疫苗在研发和生产过程中也面临着一些挑战。几乎所有内源性真核 mRNA 都有一个 5′ 帽（一种 N7 - 甲基化鸟苷，通过反向 5′ 至 5′ 三磷酸键与 RNA 的第一个核苷酸相连，即 5′ m?G 帽），在转录后加工过程中添加。这个小小的 5′ 帽在转录剪接、核质运输、蛋白质翻译以及抵御 5′ 外切核酸酶等方面都起着至关重要的作用。大多数体外合成的 mRNA 同样需要这个 5′ 帽，添加它的过程既复杂又昂贵，无论是在转录过程中使用各种抗反向帽类似物或 CleanCap? 加帽技术，还是转录后使用诸如痘苗病毒来源的加帽酶，都增加了生产成本和时间成本。要是能设计出一种不需要 5′ 帽就能正常发挥功能的 mRNA，那就能大大降低成本，提高生产效率。

此外，内部核糖体进入位点（IRES）虽然是一些 mRNA 中能让核糖体启动翻译的特殊区域，但它在 mRNA 疫苗领域的应用还不够广泛。而且，没有 5′ 帽保护的 mRNA，其 5′ 端极易受到外切核酸酶的攻击，稳定性很差，这也限制了相关研究的进展。

为了解决这些问题，美国南阿拉巴马大学的研究人员在《NPJ Vaccines》期刊上发表了一篇名为 “Capless mRNA vector expressing influenza A hemagglutinin elicits protective immunity in mice” 的论文。他们经过一系列研究，成功设计出了一种新型的 mRNA 载体，这种载体不需要 5′ 帽就能发挥作用，并且在小鼠实验中展现出了良好的免疫保护效果，为 mRNA 疫苗的发展开辟了新的道路。

研究人员在开展这项研究时，用到了几个关键的技术方法。首先是构建多种表达质粒和模板质粒，用于转录不同结构的 mRNA，通过对质粒的设计来调整 mRNA 的结构，如是否含有 IRES、5′ 端的发夹结构以及 3′ 端是发夹还是 poly (A) 尾等。其次，使用细胞转染技术，将合成的 mRNA 和质粒转染到 MDCK 细胞（Madin - Darby 犬肾细胞系）和小鼠骨骼肌细胞中，以检测 mRNA 的表达情况。最后，进行动物实验，给小鼠接种不同的 mRNA 疫苗，观察小鼠产生的免疫反应以及在感染流感病毒后的生存情况 。

下面我们来详细看看他们的研究结果。

5’端带有双发夹的无帽含 IRES 的 mRNA 载体的功能

研究人员之前发现，一种无 5′ 帽的 mRNA 载体，只要在 5′ UTR（非翻译区）包含 IRES 来启动翻译，并在两端带有三发夹结构来保护其免受外切核酸酶的降解，就能比传统的（有帽）mRNA 载体更有效地表达 eGFP（增强型绿色荧光蛋白）。为了简化 mRNA 载体的设计，他们这次测试了如果 5′ 端只带有双发夹而不是三发夹，载体的表达效率会如何变化。

他们设计了多种实验和对照 mRNA 载体，实验载体的 5′ UTR 包含脑心肌炎病毒（EMCV）的 IRES，用于驱动 eGFP 的表达，并且在 5′ 端带有发夹结构，3′ 端结构则有所不同，有的是发夹，有的是 poly (A) 尾。结果发现，没有发夹和 poly (A) 尾的对照 mRNA 载体（Vector A）无法表达 eGFP，而两端带有三发夹的载体（Vector B）则能成功表达 eGFP，这和他们之前的研究结果一致。有趣的是，当把两端的三发夹换成双发夹时（Vector C），eGFP 的表达效果相当。但如果把双发夹缩短，eGFP 的表达就会显著下降（Vector D）。基于这些结果，他们选择了较长的（30 nt）5′ 端双发夹来进一步研究 3′ 端结构对载体性能的影响。

研究还发现，将 3′ 端的双发夹替换为 74 nt 的 poly (A) 尾，能显著提高 eGFP 的表达（Vector E）；而在终端 74 nt poly (A) 尾上游 10 nt 处加入一个 30 nt 的 poly (A) 片段（Vector F），反而会使 eGFP 的表达略有下降。另外，如果去掉 IRES（Vector G）或者 5′ 端的双发夹（Vector H），eGFP 的表达就会大幅降低，这表明 IRES 和 5′ 端双发夹是功能性无帽 mRNA 载体的必备组件。

带有 5’端发夹的内源性和外源性 mRNA 都需要 IRES 来表达蛋白质

mRNA 的 5′ 帽是经典翻译所必需的。那么，5′ 端的双发夹会不会干扰从转染的 DNA 质粒转录的内源性 mRNA 的帽依赖性翻译呢？研究人员设计了几种用于细胞内 mRNA 转录的 DNA 质粒载体，并在 MDCK 细胞中进行测试。

结果显示，对照 DNA 质粒 I 能强劲表达 eGFP，而在预测转录本的 5′ 端添加双发夹（质粒 II）则会阻止 eGFP 的表达，但在 GFP ORF（开放阅读框）上游添加 IRES（质粒 IV）后，eGFP 的表达又能恢复到约一半的最高水平。有意思的是，表达质粒 III 生成的 mRNA 转录本既有 5′ 帽又有 IRES，但没有 5′ 端发夹，其 eGFP 表达却很少，这表明 5′ 帽和 IRES 之间可能存在翻译起始冲突，而发夹结构可以避免这种冲突。

为了更直接地比较同一 mRNA 转录本上帽依赖性和 IRES 依赖性的蛋白质表达，研究人员对这四种 DNA 质粒进行了修改，添加了 mCherry ORF 和一个短的 20 bp 接头。结果发现，第一个基因 mCherry 只有在转录的 mRNA 没有 5′ 端双发夹时才会表达，而第二个基因 eGFP 只要其上游有功能性 IRES，无论 5′ 端是双发夹还是帽结构，都能表达。这就证实了，那些含有 5′ 端发夹但缺乏上游 IRES 的质粒不能表达蛋白质，不是因为转录本降解，而是翻译失败。

研究人员还设计了两种体外合成的 mRNA 模板，以明确 5′ 端的双发夹是否会直接抑制有帽 mRNA 的表达。结果发现，5′ 端带有双发夹的 mRNA，无论是否加帽，mCherry 都无法表达，而 eGFP 因为是从 IRES 启动翻译，所以在所有测试的 mRNA 中都能表达，只是表达水平有所差异。这表明 5′ 端双发夹会直接干扰 mCherry 的帽依赖性翻译。

无帽 mRNA 载体的聚腺苷酸化和去磷酸化对体外 HA 表达和体内抗 HA 抗体诱导的影响

研究人员接着测试了 5′ 端由双发夹保护的无帽 mRNA 能否高水平表达膜抗原，从而作为疫苗使用。他们选择了流感 A 病毒的表面蛋白血凝素（HA）作为抗原，将其编码基因替换之前载体中的 eGFP，转染到 MDCK 细胞和从小鼠分离的肌细胞及部分融合的肌管（MC）中。

结果显示，与 eGFP 的表达结果不同，两端带有双发夹的 mRNA 载体（Vector C (HA)）在 MDCK 细胞和小鼠肌细胞中表达的 HA 量极少，几乎和没有发夹的载体（Vector A (AH)）表达水平相当。但将 3′ 端的发夹替换为 74 nt 的 poly (A) 尾后（Vector E (HA)），HA 的表达显著提高。而将 3′ 端双发夹替换为更长的分段 poly (A) 尾（30 nt + 74 nt）（Vector F (HA)），并没有比单一较短的（74 nt）poly (A) 尾载体更能提高 HA 的表达。

由于体外合成的常规 mRNA 加帽效率并非 100%，5′ 端可能会残留三磷酸，从而激活细胞免疫反应。研究人员对所有 mRNA 进行碱性磷酸酶处理，去除 5′ 端的三磷酸，结果发现去磷酸化对 MDCK 细胞中 HA 的表达没有显著影响。

随后，他们用表达最好的体外无帽 mRNA 载体（E (HA)）在小鼠中进行测试，发现接种这种无帽双发夹 HA - mRNA 疫苗后，小鼠体内产生了显著的 HA 抗体滴度，而且去除 5′ 端三磷酸（E (HA)-ph）对小鼠体内抗 HA 滴度也没有显著影响。

接种表达 HA 的无帽含 IRES 的 mRNA 疫苗可保护小鼠免受致死剂量的甲型流感病毒感染

最后，研究人员测试了编码全长流感 A 病毒表面蛋白血凝素（HA），并在 5′ 端具有双发夹结构和 EMCV IRES 的无帽 mRNA 载体，能否保护 BALB/c 小鼠免受流感 A 病毒的侵害。

他们选择了之前实验中产生最高抗 HA 滴度的 mRNA 载体 E (HA)，以表达 eGFP 的 mRNA 载体 E 作为阴性对照。给小鼠接种疫苗后，测量小鼠血清中的抗 HA 抗体滴度，然后用 50 倍致死剂量的活流感 A 病毒（A/PR/8/34 株）感染小鼠。结果发现，接种 HA - mRNA 疫苗的 8 只小鼠中有 7 只产生了高抗 HA 抗体滴度，而接种对照 eGFP - mRNA 疫苗的小鼠都没有产生抗 HA 抗体。在感染病毒后，接种对照疫苗的小鼠全部死亡，而接种 HA - mRNA 疫苗的小鼠只有 1 只死亡，而且这只死亡的小鼠正是接种后没有产生高抗 HA 滴度的那只。此外，接种 HA - mRNA 疫苗的大多数小鼠体重没有下降，感染后的临床症状也很轻微。

从研究结论和讨论部分来看，这项研究意义重大。研究人员发现双发夹在稳定 mRNA 载体方面和三发夹效果相当，而且将载体 3′ 端设计为 poly (A) 尾而不是发夹，能有效表达像 HA 这样的膜蛋白，这可能与细胞质蛋白和膜蛋白或分泌蛋白的加工差异有关。这种无帽 mRNA 载体与预先形成的脂质纳米颗粒复合并注射到小鼠体内后，能产生高滴度的抗 HA IgG 抗体，使小鼠在感染 50 倍致死剂量的流感 A 病毒后大部分存活，这表明线性无帽 mRNA 也具有免疫保护作用，这在之前的研究中从未被证实过。

同时，研究还发现 5′ 端的双发夹会完全阻止体外合成的有帽 mRNA 的翻译，在体内转录的 mRNA 中也是如此。这意味着如果 mRNA 转录本的 5′ 端存在双发夹，就需要内部翻译起始位点（如 IRES）来表达蛋白质。这一发现为设计细胞特异性的无帽 mRNA 载体提供了新的思路，或许未来可以通过设计特定的 DNA 或病毒载体，让其在体内转录出 5′ 端带有发夹的 mRNA，并从 IRES 启动翻译，不过这还需要更多的研究来验证。

与合成的环状 RNA（circRNA）相比，虽然 circRNA 也能在没有 5′ 帽的情况下发挥作用，且稳定性更高，但它缺乏 poly (A) 尾，可能会影响某些膜蛋白和分泌蛋白的表达。在这项研究中，研究人员测试了分段 poly (A) 尾对无帽 mRNA 载体功能的影响，发现与较短的传统 poly (A) 尾相比，分段 poly (A) 尾并没有提高 mRNA 的性能。另外，对无帽含发夹的 mRNA 载体进行去磷酸化处理，对体外 HA 表达和体内抗 HA 抗体滴度的诱导都没有影响。

总的来说，这项研究成功设计出了一种不需要 5′ 帽的 mRNA 载体，它能高效表达流感 A 病毒的 HA 蛋白，并在小鼠体内诱导产生保护性抗体。这一成果为 mRNA 疫苗的发展提供了新的方向，有望推动 mRNA 疫苗在未来更广泛的应用，让我们在应对流感等传染病时多了一件有力的武器。