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为解决耐多药铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）治疗难题，印度国家制药教育与研究学院的研究人员开展相关研究，成功识别出新的药物靶点及抑制剂。该成果为研发新型抗菌药提供关键依据，极具科研价值，推荐阅读！
在当今全球的健康领域，传染病始终是一个棘手的难题，像 “幽灵” 一般威胁着人们的生命安全。其中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）更是被世界卫生组织列为 “高优先级病原体”，它就像一个狡猾又顽固的 “敌人”，凭借着强大的耐药能力，给临床治疗带来了巨大的挑战。
铜绿假单胞菌可谓是 “作恶多端”，它能引发多种疾病，比如在囊性纤维化（CF）患者群体中，它常常引发严重的肺部感染；在医院环境里，它也是呼吸机相关性肺炎等院内感染的常见 “肇事者” 。而且，它的耐药机制极为复杂，不仅天生具有低外膜通透性和外排泵来排出抗生素，还能通过基因突变和水平基因转移获得后天耐药性。更为可恶的是，它还会在医疗设备和宿主组织上形成生物膜，这层 “保护膜” 极大地增强了它对药物的抵抗力，使得治疗愈发困难。尽管近年来抗菌疗法有了不少进步，像头孢他啶 - 阿维巴坦、头孢洛扎 - 他唑巴坦等药物相继问世，但铜绿假单胞菌的耐药性仍在不断增强，研发有效治疗手段的脚步似乎总是赶不上它耐药的速度。同时，企业对抗生素研究的投资逐渐减少，合适的分子靶点又十分稀缺，这无疑让情况雪上加霜，寻找新的治疗靶点和药物迫在眉睫。
在这样的困境下，印度国家制药教育与研究学院的 Divya Vemula 和 Vasundhra Bhandari 两位研究人员，在《Heliyon》期刊上发表了一篇名为 “Proteome-wide identification of druggable targets and inhibitors for multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using an integrative subtractive proteomics and virtual screening approach” 的论文。他们通过深入研究，成功找到了针对耐多药铜绿假单胞菌的潜在药物靶点和抑制剂，这一成果就像黑暗中的一盏明灯，为攻克铜绿假单胞菌感染带来了新的希望。
为了开展这项研究，研究人员采用了多种关键技术方法。他们先是运用减法蛋白质组学（一种通过比较病原体与宿主蛋白质组，筛选出病原体特有蛋白质的方法）来识别铜绿假单胞菌 PAO1 核心蛋白质组中的潜在药物靶点；接着，利用虚拟筛选技术从大量化合物中筛选出可能有效的分子；然后，借助分子动力学模拟、MMPBSA（分子力学 - 泊松 - 玻尔兹曼表面面积分析）和 DFT（密度泛函理论）计算等手段，对筛选出的化合物进行深入分析，评估它们与靶点的结合稳定性和反应活性 。
下面我们来详细看看他们的研究成果：
1. 蛋白质序列检索与数据集准备
研究人员从 UniProt 数据库中获取了铜绿假单胞菌 PAO1 菌株的完整蛋白质组，初始数据集包含 5563 个蛋白质序列。经过一番 “精心筛选”，去除了那些含有非氨基酸残基、模糊字符或长度过短（小于 50 个氨基酸）的序列，最终得到了 5549 个蛋白质，并将它们整理成 FASTA 文件，为后续研究做好准备。这一步就像是在众多 “零件” 中挑选出能用的部分，为后续的 “组装” 工作奠定基础。
2. 序列分析与比较搜索
为了找到那些与人类蛋白质不同的、有可能成为治疗靶点的蛋白质，研究人员利用 BLASTp 工具，将铜绿假单胞菌的蛋白质序列与人类蛋白质组进行比对。就像在两个巨大的 “基因库” 中寻找差异，这一比对发现有 394 个蛋白质与人类蛋白质有显著同源性，这些被排除在外，剩下的 5155 个蛋白质则进入下一步研究。然后，研究人员又通过 DEG - 15 数据库，找到了其中 149 个与细菌生存密切相关的必需蛋白质，这些 “幸运儿” 成为了潜在的治疗靶点。
3. 代谢途径分析与亚细胞定位
研究人员把这些非同源必需蛋白质映射到京都基因与基因组百科全书（KEGG）的代谢途径数据库中。经过对比发现，在这 149 个蛋白质里，有 87 个参与的代谢途径是人类所没有的，这就意味着针对这些蛋白质开发药物，能降低对人体细胞的副作用，它们因此被优先考虑用于药物开发。同时，研究人员还利用 PSORTb 工具预测这些蛋白质在细胞内的位置，发现其中 77 个位于细胞质，10 个与细胞膜相关，不同的位置也暗示着它们在药物研发中的不同作用。
4. 可成药性评估
这一步研究人员借助 DrugBank 数据库来评估这些蛋白质的可成药性，就像是给这些潜在靶点 “打分”。经过分析，他们从 87 个蛋白质中确定了 45 个独特的靶点。这些靶点就像是隐藏在铜绿假单胞菌体内的 “关键开关”，如果能找到合适的 “钥匙”（药物）来操控它们，就能抑制细菌的生长。
5. 毒力因子和抗生素抗性分析
研究人员利用毒力因子数据库（VFDB）和综合抗生素抗性数据库（CARD），对这 45 个独特靶点进行 “深度挖掘”。结果发现其中 10 个蛋白质与已知的毒力因子有关，比如脂多糖、菌毛等，这些毒力因子在细菌感染人体的过程中起着重要作用；还有 5 个蛋白质与抗生素抗性有关，它们参与了铜绿假单胞菌对多种药物的耐药过程。这一发现让我们对铜绿假单胞菌的 “防御机制” 有了更深入的了解。
6. 广谱靶点鉴定
研究人员通过 BLASTp 工具，将已识别的靶点与多种医学上重要的物种和细菌病原体的蛋白质组进行比较。这一比较发现了不少 “潜力股”，有 14 个蛋白质被确定为广谱靶点，它们在多种病原体中都存在且具有相似性。这意味着针对这些靶点开发的药物，有可能像 “万能钥匙” 一样，对多种病原体都有治疗效果，为开发广谱抗菌疗法提供了新的方向。
7. 蛋白质理化性质分析
研究人员对 14 个蛋白质的理化性质进行了评估，包括分子量、等电点、亲水性等。他们发现这些蛋白质的理化性质各不相同，只有 6 个满足特定的理化标准，其他的因为不稳定等原因被 “淘汰”。这一步就像是在挑选运动员，只有符合一定 “身体素质” 标准的蛋白质，才有资格成为药物研发的重点关注对象。
8. 功能注释和进化分析
通过多个数据库对蛋白质进行功能注释和进化分析，研究人员发现不同蛋白质有着不同的 “功能秘密”。比如 HxcU 假菌毛和趋化特异性甲酯酶参与了 II 型分泌系统，与菌毛形成和趋化有关；咪唑甘油磷酸合酶亚基 HisF2 在组氨酸生物合成中起着关键作用。同时，通过系统发育分析，还发现这些蛋白质在进化上分为不同的类别，它们之间的进化关系也为研究它们的功能提供了线索 。
9. 结构预测和验证
研究人员运用 PSIPRED 和 SOPMA 这两种工具预测蛋白质的二级结构，发现不同蛋白质的二级结构各有特点，有的以随机卷曲为主，有的则以 α - 螺旋为主。在三级结构预测方面，除了一个蛋白质有实验测定的结构外，其他五个蛋白质的三维结构模型是通过 AlphaFold 蛋白质结构数据库预测得到的。通过 Ramachandran 图评估，这些模型的可靠性都很高。而且，利用 SiteMap 工具分析发现，有四个蛋白质具有可成药性，其中包括 Preprotein translocase subunit SecD、Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisF2 和 Chemotaxis - specific methylesterase，它们在所有有毒力的铜绿假单胞菌物种中都存在，有望成为泛药靶点。
10. 虚拟筛选
研究人员针对 Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisF2、Chemotaxis - specific methylesterase 和 Preprotein translocase subunit SecD 这三个目标蛋白质，进行了基于受体的虚拟筛选。他们从包含 4,648,867 个分子的配体数据集中，通过分子对接分析找出了每个蛋白质的前五个 “命中” 化合物。这些化合物就像是从众多 “候选人” 中脱颖而出的佼佼者，它们与目标蛋白质的结合亲和力和其他相关分数都显示出它们有可能成为有效的抑制剂 。
11. 命中化合物的可成药性分析
利用 Schrodinger 2023 的 QikProp 模块对这些命中化合物的药代动力学性质进行评估后发现，大多数化合物的性质都在可接受范围内，这表明它们有成为有效药物的潜力，为后续的研究增添了信心。
12. 分子动力学模拟
研究人员对筛选出的化合物进行了 100 ns 的分子动力学模拟，从多个角度评估了它们与蛋白质结合的稳定性。通过 RMSD（均方根偏差）分析发现，不同化合物与蛋白质形成的复合物稳定性不同。例如，在与 Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisF2 结合的化合物中，hit2 和 hit5 表现出较好的稳定性；在与 Chemotaxis - specific methylesterase 结合的化合物中，hit1、hit3 和 hit5 的稳定性较高；与 Preprotein translocase subunit SecD 结合的化合物中，hit1、hit2、hit3 和 hit5 也显示出不同程度的稳定性 。此外，通过 RMSF（均方根波动）、Rg（回转半径）、MolSA（分子表面积）、SASA（溶剂可及表面积）和 PSA（极性表面积）等分析，进一步验证了这些化合物与蛋白质结合的稳定性和相互作用情况。综合这些分析结果，确定了一些最有前景的化合物，它们在与目标蛋白质结合时表现出了优秀的稳定性和相互作用特性。
13. MMPBSA 分析
通过 MMPBSA 计算，研究人员评估了最终蛋白质 - 药物复合物的稳定性。结果显示，Chemotaxis - specific methylesterase 与 hit5（STL321396）的结合能达到 - 10.99 kcal/mol，Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisF2 与 hit5（STK417467）的结合能为 - 10.01 kcal/mol，Preprotein translocase subunit SecD 与 hit3（STL243336）的结合能为 - 28.26 kcal/mol 。这些数据表明，这些化合物与目标蛋白质之间形成了稳定的结合，是极具潜力的抗生素候选物。
14. 密度泛函理论计算
DFT 计算对三个预测的抑制剂 STK417467、STL243336 和 STL321396 的电子性质进行了研究。结果发现，STK417467 具有最大的 HOMO - LUMO 能隙，表明它稳定性高、反应性低，适合抑制 HisF2；STL243336 的能隙适中，稳定性和反应性较为平衡，适合与 SecD 相互作用；STL321396 的能隙最小，反应性最强，适合靶向 Chemotaxis - specific methylesterase 。这些结果从电子层面解释了这些化合物与目标蛋白质之间的相互作用特性，为药物设计提供了重要的理论依据。
总的来说，这项研究通过综合运用多种技术方法，成功识别出了铜绿假单胞菌的三个新的潜在药物靶点：Preprotein translocase subunit SecD、Chemotaxis - specific methylesterase 和 Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisF2，并找到了针对这些靶点的潜在抑制剂，如 STK417467、STL321396 和 STL243336 。这些发现为开发治疗耐多药铜绿假单胞菌感染的新型抗生素提供了重要的理论基础和有潜力的候选化合物，就像为医药研发人员提供了一张 “宝藏地图”，指引着他们找到对抗铜绿假单胞菌的新武器。同时，研究中所使用的计算框架和方法，也为其他病原体的药物靶点发现和抑制剂开发提供了有益的参考，有望推动整个抗菌药物研究领域的发展，让我们在与传染病的斗争中取得更多的胜利。
