基于表面等离子共振筛选的双峰驼源抗A型肉毒毒素单域抗体的发现与功能研究

本研究针对目前缺乏A型肉毒神经毒素（BoNT/A）特异性治疗药物的难题，通过免疫双峰驼构建噬菌体展示文库，创新性采用SPR（表面等离子共振）筛选技术获得高亲和力（1.08E-11 M）中和抗体HM。该抗体通过阻断BoNT/AHCC与SV2C受体的结合，在细胞和动物模型中展现出显著中和效果，为开发新型抗毒素制剂提供了重要候选分子。

　　

肉毒神经毒素（BoNT）作为自然界最致命的毒素之一，其A型毒素（BoNT/A）仅需1-2 ng/kg剂量即可致人死亡，被美国疾控中心列为A级生物威胁剂。尽管该毒素在医美领域有广泛应用，但中毒后缺乏特异性解毒药物的现状始终是重大公共卫生隐患。传统马源抗血清存在过敏风险，而常规抗体开发面临抗原构象敏感、中和表位难定位等技术瓶颈。

北京药理毒理研究所的研究团队创新性地选择双峰驼作为免疫动物，利用其特有的重链抗体（VHH）基因资源，以BoNT/AHC_C结构域为靶点展开研究。通过五轮免疫程序使血清效价达1:8000后，构建了容量6×10⁹的高质量噬菌体文库。研究突破性地采用"双轨筛选"策略：先通过直接包被法获得高亲和力（3.624E-10 M）但无中和活性的A1抗体；继而以A1为支架建立间接筛选体系，最终获得能竞争性阻断SV2C结合的中和抗体HM。相关成果发表在《Heliyon》期刊，为抗毒素研发提供了新思路。

关键技术包括：1）双峰驼免疫与VHH噬菌体文库构建；2）表面等离子共振（SPR）实时监测抗体-抗原互作；3）计算机辅助的3D结构模拟预测表位；4）Neuro-2a细胞结合抑制实验；5）小鼠20 LD₅₀毒素攻毒模型验证。

【发现与表征新型VHH】

通过ELISA和SPR筛选获得优势克隆A1，虽对BoNT/AHC_C有高亲和力，但动物实验显示其中和活性缺失。计算机模拟揭示A1结合表位（1034RLI¹⁰³⁶等）远离SV2C相互作用区。

【VHH抑制毒素-受体结合】

SPR竞争实验显示，HM可剂量依赖性降低BoNT/AHC_C与SV2C的结合信号（Ru值）。免疫荧光证实HM（100 μg/mL）使Neuro-2a细胞荧光强度降低83%，证实其细胞水平阻断效应。

【体内中和效果验证】

在20 LD₅₀攻毒模型中，10 mg/kg HM实现100%保护率；即使面对200 LD₅₀超致死剂量，仍能延长小鼠生存时间至40小时以上。剂量效应显示5 μg/kg HM即可完全中和LD₁₀₀毒素。

该研究通过创新筛选策略解决了构象敏感性抗原的抗体开发难题：1）发现A1可作为"构象稳定剂"辅助暴露关键表位；2）证实SPR指导的功能性筛选优于传统ELISA方法；3）HM抗体通过占据1155Y-1190E关键残基实现高效中和。研究不仅获得两项国家专利（CN202410180148.1和CN202311169052.7），更建立了针对复杂蛋白毒素的抗体开发范式——将计算模拟、SPR实时验证与功能性筛选相结合，为抗毒素药物研发提供了可推广的技术路线。值得注意的是，HM的皮摩尔级亲和力（1.08E-11 M）创造了同类抗体的新纪录，其小型化单域结构更利于穿透组织屏障，具有重要转化医学价值。