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为解决血友病 B 治疗难题，韩国加图立大学研究人员开展用工程化 FIX 分泌肝细胞片治疗血友病 B 的研究。结果显示该细胞片能长效分泌 FIX，意义重大。这一成果极具价值，推荐科研读者阅读。
血友病 B 是一种常见的出血性疾病，每 40000 名男性中就有一人患病。它是由于血液中凝血因子 IX（FIX）缺乏导致的，而 FIX 基因的突变是罪魁祸首。这个基因含有八个外显子和 2780bp 的转录本，目前已知血友病 B 患者中存在超过 3656 种突变，包括点突变、多态性、外显子缺失、重复和插入缺失等。根据 FIX 的活性水平，患者又被分为重症（FIX 活性低于 1IU/dL）、中度（FIX 活性在 1 - 5IU/dL 之间）和轻度（FIX 活性在 5 - 40IU/dL 之间）。
血友病 B 患者的日子可不好过，常常被诊断出患有严重疾病，频繁出现自发性和复发性关节出血。这不仅让他们身体上承受着巨大的痛苦，还可能引发关节炎、畸形等并发症，增加残疾和死亡的风险。而且，治疗费用也是个沉重的负担。目前，患者需要频繁注射凝血因子浓缩物，标准半衰期的 FIX 每周要注射 2 - 3 次，延长半衰期的 FIX 每 2 - 3 周注射一次。这不仅花费高昂，还可能产生副作用，比如产生中和抗体。在发展中国家，情况更严峻，只有 20% 的全球人口能够负担得起血友病的治疗费用，而且现有的治疗方法还存在血源传播的风险。
为了解决这些问题，研究人员一直在寻找更好的治疗方法。肝细胞移植因为能提供 FIX 蛋白，成为了研究的方向之一。不过，供体的缺乏限制了它的应用。于是，研究人员把目光投向了干细胞，间充质干细胞（MSCs）、胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）都有可能分化成能产生 FIX 的肝细胞。其中，iPSCs 因为具有多能性、伦理问题较少、易获取且免疫排斥风险低等优点，成为了本次研究的 “主角”。
随着干细胞革命，基因组工程技术也取得了很大进展，CRISPR/Cas 系统因其结构简单、基因编辑精确，比锌指核酸酶和转录激活样效应核酸酶等工具更受青睐。不过，基因工程干细胞在临床应用中还面临着一些挑战，比如移植细胞归巢性差、细胞异质性、递送困难和体内脱靶问题等。而细胞片技术作为一种理想的细胞递送工具，能有效解决这些问题，它可以精确地将细胞移植到靶组织，避免支架材料的毒性和排斥问题。
基于以上背景，韩国加图立大学（Gachon University）的研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》期刊上发表了题为 “Engineered factor IX-secreting hepatocyte sheets for the treatment of hemophilia B: a translational approach using induced pluripotent stem cells” 的论文。研究人员通过一系列实验，成功制备了能分泌 FIX 的肝细胞样细胞片，为血友病 B 的治疗带来了新的希望。他们发现，这种工程化的细胞片在体外和体内都能长时间分泌 FIX 蛋白，相比传统的单细胞注射，具有更好的治疗效果，为血友病 B 的治疗开辟了新的途径。
在这项研究中，研究人员用到了几个关键的技术方法。首先是 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，利用它将人类 FIX 基因插入到 iPSCs 的 APOC3 位点，使 iPSCs 能够分泌 FIX。其次是细胞片技术，通过温度响应性聚合物接枝细胞培养皿（TRCD），利用温度变化（从 37°C 降至室温）制备细胞片，这种方法可以在不使用酶处理和支架的情况下，获得紧密连接的细胞片。另外，研究人员还运用了细胞培养和分化技术，将 iPSCs 诱导分化为肝细胞，并对其进行培养和鉴定。
下面我们来看看具体的研究结果：
- 成功整合人类 FIX 基因到 iPSCs 的 APOC3 位点：研究人员设计了一个 2kb 的载体，通过 CRISPR/Cas9 系统将其整合到 iPSCs 的 APOC3 位点。经过单细胞克隆筛选和测序验证，发现整合的序列没有错配。而且，FIX 分泌型 iPSCs 表达多能性相关标记 OCT4、SOX2、KLF4 和 Nanog，这表明载体转染没有改变 iPSCs 的多能性。
- FIX Ki-iPSCs 增强了 FIX 基因表达和蛋白分泌，且不影响肝细胞分化能力：研究人员将 WT-iPSCs 和 FIX KI-iPSCs 逐步分化为确定性内胚层（DE）、肝内胚层（HE）、未成熟肝细胞（IMH）和成熟肝细胞（MH）。在 MH 阶段，两组细胞的形态都变成了肝细胞样。qRT-PCR 数据显示，两组细胞中分化肝细胞特异性标记物（HNF4a 和 AFP）的水平相似，但 FIX KI-iPSC 组的 FIX 基因表达和蛋白分泌水平显著高于 WT-iPSC 组。这说明 FIX 基因敲入过程没有改变 iPSCs 的肝细胞分化能力，且 FIX 基因成功敲入。
- 分化的肝细胞样细胞表达功能特征和阶段特异性标记物：通过免疫细胞化学（ICC）、qRT-PCR 和吲哚菁绿（ICG）测试评估分化肝细胞的特征。ICC 分析显示，分化的肝细胞 iPSC 标记物（OCT4 和 SOX2）呈阴性，肝细胞特异性标记物（HNF4a 和 AFP）呈阳性。qRT-PCR 分析表明，随着分化阶段的推进，DE、HE、IMH、MH 阶段的 FOXA2、HNF4a、AFP 和白蛋白（Alb）水平逐渐升高。ICG 测试显示，分化的肝细胞样细胞具有化学摄取和分泌功能，能摄取和排泄 ICG 试剂。这表明 FIX KI-iPSCs 成功分化为功能性肝细胞。
- 从肝内胚层阶段细胞制备的细胞片具有优越的形态和肝脏特征：为了制备肝细胞样细胞片，研究人员在 iPSC、HE 和 IMH 阶段将分化细胞从普通组织培养板转移到温度响应性细胞培养皿（TRCD）中培养至 MH 阶段。结果发现，iPSC/MH 和 DE/MH 组的细胞无法附着在 TRCD 上，HE/MH 组细胞呈现立方体形肝细胞样形态和明显的细胞间连接，而 IMH/MH 组细胞形态扁平。而且，HE/MH 组制备的细胞片比 IMH/MH 组更厚、更大，且表达更高水平的肝细胞特异性标记物。这说明 HE 阶段的细胞适合制备功能性细胞片。
- 工程化细胞片相比传统组织培养塑料系统，表现出增强的肝细胞特异性和细胞粘附蛋白标记：通过 H&E、IHC 和 qRT-PCR 分析评估工程化细胞片的肝细胞特征。IHC 分析显示，工程化细胞片 SOX2（iPSC 标记）呈阴性，FIX、HNF4a 和 AFP（肝细胞标记）呈阳性。qRT-PCR 分析表明，细胞片形成增强了细胞粘附蛋白（F - 肌动蛋白、β- 连环蛋白和 NCAM1）的表达，且细胞片组肝细胞标记物（HNF4a、AFP、Alb）的表达水平比在组织培养塑料（TCP）上培养的细胞组高得多。
- 细胞片相比单细胞增强了凝血 FIX 蛋白的分泌：单细胞组的分化肝细胞形态细长，与典型肝细胞不同，且由于缺乏细胞间连接，无法维持肝细胞特征和活力，无法培养到 20 天。而细胞片组在 20 天内保持了肝细胞形态，且在接种后 1 - 5 天，细胞片组分泌的 FIX 蛋白比单细胞组高 5 - 11 倍。
- 细胞片移植在 NOD - SCID 小鼠中保留了 FIX 分泌功能：研究人员将细胞片和单细胞移植到 NOD - SCID 小鼠的肝脏表面。细胞片移植过程顺利，且在移植后两周，细胞片仍在肝脏表面，表达人类特异性标记物（波形蛋白）和 FIX。而单细胞注射后，部分小鼠在 1 小时内死亡，且注射的单细胞在肝脏血管中积累，可能阻塞血液循环。qRT-PCR 分析显示，细胞片组人类细胞 GAPDH 基因和 FIX 基因的表达水平显著高于单细胞组。这表明移植的细胞片在体内至少两周内保持了功能。
研究人员通过实验成功制备了源自 iPSCs 的肝细胞样细胞片，并将细胞片技术与基因组编辑平台相结合，用于血友病 B 的治疗研究。实验结果表明，这种工程化的 FIX 分泌型细胞片在分泌 FIX 蛋白的时间上比目前的细胞治疗工具更长，为血友病 B 的治疗提供了新的思路和方法。不过，研究也存在一些局限性，比如没有在疾病模型上评估细胞片的治疗效果，细胞片和单细胞组之间的细胞剂量差异可能影响实验结果等。未来的研究需要进一步解决这些问题，以推动这项技术从实验室走向临床应用，为广大血友病 B 患者带来真正的福音。
