警惕！牛冠状病毒 HE 变异株现身，跨物种传播风险几何？

为明确牛冠状病毒（BCoV）HE 变异的生物学后果及流行情况，宁夏研究人员开展 BCoV HE 缺失 / 插入变体研究。结果显示该变体在牛群中流行且具不同生物学特性。推荐阅读，助您了解 BCoV 进化及跨物种传播风险。

　　

在牛的世界里，有一种病毒时刻威胁着它们的健康，那就是牛冠状病毒（BCoV）。BCoV 在牛群和野生反刍动物群体中广泛存在，就像一个隐藏在暗处的 “健康杀手”，它能引发腹泻、冬季痢疾以及牛呼吸道疾病综合征等，给养牛业带来了巨大的经济损失。

BCoV 属于 β 冠状病毒属（Betacoronavirus）中的 β 冠状病毒 1 种（Betacoronavirus 1），它的基因组是单链正链 RNA，还带着一层脂质包膜。这个病毒很 “狡猾”，具有组织嗜性，专门侵害牛的呼吸道和胃肠道。虽说之前有研究发现了一些可能与肠道和呼吸道表型相关的突变，但这些发现并没有在实验中得到确切证实。更让人担忧的是，BCoV 不仅在牛群中肆虐，BCoV 样冠状病毒还在人类身上被检测到过，而且人类冠状病毒 OC43（HCoV-OC43）就是由 BCoV 溢出产生的，这无疑给人类健康也敲响了警钟，让大家意识到这种病毒存在人畜共患的可能性。

近年来，一种新型的 BCoV 变体出现了，它的血凝素酯酶（HE）受体结合域（RBD）发生了 12 个核苷酸的缺失或插入突变。这一变化就像给病毒披上了一件新 “外衣”，但人们对这件 “外衣” 带来的影响却知之甚少。这些突变会给病毒带来哪些生物学变化？这种变体在牛群中的流行情况究竟如何？这些问题都亟待解决。为了弄清楚这些，宁夏相关研究人员在《BMC Veterinary Research》期刊上发表了一篇名为 “Characterization of bovine coronavirus hemagglutinin - esterase deletion/insertion variants in Ningxia, China” 的论文。研究发现，BCoV HE 缺失 / 插入变体在牛群中较为流行，并且展现出了不同的生物学特性。这一发现意义重大，它让我们对 BCoV 的流行和进化有了更深入的了解，也提醒我们要警惕这些变体，因为它们很可能会增加病毒跨物种传播的风险。

研究人员在开展这项研究时，用到了几个关键技术方法。首先是逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），这个技术就像是病毒的 “探测器”，能检测样本中是否存在 BCoV，还能扩增出病毒的基因。其次是细胞培养技术，研究人员用 HRT-18 细胞来分离和培养 BCoV，观察病毒的生长情况。还有基因测序技术，它可以测定病毒基因组序列，帮助研究人员了解病毒的基因特征。另外，分子对接技术和构建生长曲线也很重要，分子对接能分析病毒蛋白与受体的结合情况，生长曲线则能直观地展示病毒的生长特性。

下面我们来看看具体的研究结果。

1. BCoV 检测和基因扩增：研究人员从宁夏 5 个牛场收集了 47 份腹泻样本和 47 份鼻拭子样本。通过 RT-PCR 检测发现，鼻拭子样本中 BCoV 的阳性率（51.06%）明显高于腹泻样本（21.28%），这表明 BCoV 在呼吸道中的存在感更强，也提示我们在检测呼吸道病原体时，可不能忽视 BCoV。而且，研究人员成功从 34 份 BCoV 阳性样本中扩增出了 11 个完整的 HE 基因和 8 个完整的 S 基因，为后续研究提供了重要的基因材料。
2. BCoV 分离和鉴定：研究人员把 34 份阳性样本接种到 HRT-18 细胞中进行培养。经过一番努力，他们成功分离出了 8 株 BCoV，其中 7 株在培养过程中出现了明显的细胞病变效应（CPE），表现为细胞变圆、收缩和脱落，就像细胞受到了病毒的 “攻击”，失去了原本的形态。还有 1 株没有明显 CPE，但被鉴定为 HE 缺失变体。通过间接免疫荧光试验（IFA）、电子显微镜观察和蛋白质免疫印迹（Western blot）等方法，研究人员确定这些分离出的病毒就是 BCoV，并且还测定了病毒的滴度。
3. 分离株的基因组特征：研究人员对 4 株病毒（HE 插入变体、HE 缺失变体、HE 非变体和肠道分离株）进行了全基因组测序。结果发现，这 4 株病毒的基因组长度在 31023 - 31044 nt 之间，G + C 含量为 36.97 - 37.07%，具有标准的 BCoV 基因组结构。通过序列比较发现，它们与 GenBank 中已有的 212 个 BCoV 基因组有较高的核苷酸同一性。在进行系统发育分析时，研究人员发现中国的 BCoV 菌株（除了中国牦牛菌株）聚成了一个独立的大分支，属于基因型 GIII。而且，中国的 HE 缺失 / 插入变体和美国的变体在进化树上并没有聚在一起，这说明它们没有近期的共同祖先。
4. S 基因的分子特征：研究人员分析的 8 个 S 基因长度均为 4092 bp，编码 1363 个氨基酸的蛋白质。通过构建系统发育树发现，这些 S 基因分布在遗传树的三个分支上，显示出了遗传多样性。并且，不同临床来源（呼吸道或肠道）的 BCoV 分离株在 S 基因上并没有明显的分化，但部分菌株存在独特的氨基酸变异，比如肠道菌株 F226-HE424 和呼吸道菌株 B236、B226 在 S1 亚基上有相同的 N338S 变异，F226-HE424 在 S2 亚基上还有独特的 E858G 变异。
5. HE 基因的分子特征：11 个 HE 基因长度在 1263 - 1287 bp 之间，编码 420 - 428 个氨基酸的蛋白质。系统发育树显示，这些 HE 基因分布在四个不同分支，同样体现了遗传多样性。其中，有 3 株菌株的 HE 基因在 R3 环的 F211 和 L212 之间插入了 12 个核苷酸，导致增加了 4 个氨基酸（KATV）；还有 1 株菌株 B277b-HE420 的 HE 基因在 R3 环发生了 12 个核苷酸的缺失，缺失了 208NGKF211 这 4 个氨基酸。并且，中国的 HE 缺失变体和美国的 HE 缺失变体在进化树上也不在一起，说明它们的进化路径不同。
6. 分子对接：研究人员根据牛冠状病毒 HE 的晶体结构构建了三维模型，进行分子对接研究。结果发现，插入 4 个氨基酸（KATV）和缺失 4 个氨基酸（208NGKF211）都会破坏形成 RBD 的 β - 折叠二级结构。分子对接数据显示，O - 乙酰化唾液酸能与 BCoV 的不同菌株在 RBD 自发结合，而且插入 4 个氨基酸的 B298-HE424 菌株与 O - 乙酰化唾液酸的亲和力更强，这意味着这种插入突变可能更有利于病毒粒子的附着。
7. 一步生长曲线：研究人员通过绘制一步生长曲线来观察不同变体的生长特性。结果发现，HE 插入变体（B298-HE428）和 HE 非变体（B277a-HE424）在 72 h 出现了明显的 CPE，而 HE 缺失变体（B277b-HE420）则没有出现 CPE。在病毒滴度方面，HE 插入变体在多个时间点的滴度都高于 HE 非变体，而 HE 非变体又高于 HE 缺失变体，这表明 HE 缺失变体的病毒滴度较低，可能具有非细胞病变效应。
8. 重组分析：为了探究中美 HE 变体的起源，研究人员对 216 个 BCoV 基因组进行了重组分析。他们发现了 7 个潜在的重组事件，其中大部分（4/7）的重组断点位于 S 和 HE 基因。中国的 HE 缺失变体（GenBank 登录号 OP866726）被预测为 HE - S 区域重组事件的可能次要亲本菌株，而中国的 HE 插入变体（GenBank 登录号 OP866728）在 NS2 - HE 区域也存在重组事件，其主要亲本菌株来自中国，次要亲本菌株来自美国。

综合研究结果和讨论部分，BCoV HE 缺失 / 插入变体在牛群中确实很流行，而且这些变体的出现带来了一系列生物学特性的改变。S 基因和 HE 基因上的突变可能会影响病毒与细胞受体的结合能力、病毒的抗原性以及病毒的传播能力。例如，S 基因的突变可能会让病毒逃避中和抗体的识别，而 HE 基因的突变则会改变病毒与受体的亲和力。并且，这些变体可能是通过重组产生的，重组事件促进了病毒的进化，增加了病毒的多样性，也可能导致新的病毒株出现，扩大病毒的宿主范围和改变组织嗜性。这一研究成果为我们防控 BCoV 提供了重要依据，让我们更加清楚地认识到这种病毒的变化，从而能够更有针对性地制定防控策略，保护牛群的健康，减少经济损失。同时，也提醒我们要加强对这类病毒的监测，警惕它们可能带来的人畜共患风险，为人类和动物的健康筑起一道坚固的防线。