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为解决三萜皂苷生产难题，研究人员开展 Rap1 过表达对酿酒酵母生产三萜皂苷影响的研究。结果发现该策略可提升产量，还能增强前体供应和异源基因表达。推荐阅读，助您了解该领域前沿成果，开拓研究思路。
在生物制造的奇妙世界里，有一种神奇的物质 —— 三萜皂苷（由一个 C30 的疏水性三萜苷元和亲水性糖基组成，具有杀虫、抗寄生虫、抗真菌、抗菌、抗癌、抗氧化和免疫刺激等多种生物活性），它在食品、化妆品和制药行业可是个 “大明星”，深受人们的喜爱。不过，想要获取它可不容易。化学合成吧，三萜皂苷那复杂的结构就像一座难以攀登的高山，挡住了前进的道路；从天然来源提取呢，把它从一堆物质里分离出来，得到纯净的化合物，又仿佛是在大海捞针，困难重重。
于是，科学家们把目光投向了微生物，其中 “一般认为安全”（GRAS）的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）脱颖而出，成为了生产三萜皂苷的热门选手。酿酒酵母不仅能表达膜结合的真核细胞色素 P450 氧化酶（CYP450s，在植物源产品如三萜类化合物的生物合成途径中是关键催化剂），产生的次生代谢产物还很少，而且它自身就有合成三萜皂苷关键前体 2,3 - 氧化角鲨烯（OSQ）的内源性途径。这可真是个宝藏微生物！
为了让酿酒酵母生产更多的三萜皂苷，科学家们想到了增加 OSQ 产量这个办法。OSQ 的合成从葡萄糖开始，要经过糖酵解、丙酮酸脱氢酶（PDH）旁路、甲羟戊酸（MVA）途径和甾醇合成途径这四个 “关卡”。之前也有不少研究在这些途径上做文章，通过调节或过表达相关基因，取得了一些成果。但这些方法大多是对单个基因进行操作，而且在这个过程中，会用到很多组成型启动子（如 TDH3、PGK1 或 PYK1，主要来源于糖酵解和核糖体蛋白启动子）。这就带来了一个问题，这些启动子会共享有限数量的转录因子，过多使用会导致转录因子竞争，就像一群人抢着坐有限的座位一样，最终每个基因的转录水平都会降低，影响三萜皂苷的生产。
有没有更好的办法呢？为了解决这些问题，研究人员展开了深入研究，并在相关领域取得了重要成果。他们在《Microbial Cell Factories》期刊上发表了题为 “Overexpression of transcriptional factor Rap1 enhances triterpenoid saponin production in Saccharomyces cerevisiae” 的论文。研究发现，过表达转录因子阻遏激活蛋白 1（Rap1，已知能上调糖酵解基因表达，并参与丙酮酸脱氢酶（PDH）旁路、甲羟戊酸（MVA）途径和甾醇合成等多种代谢途径），可以显著提高酿酒酵母中三萜类化合物的产量。这一发现为三萜皂苷的生产开辟了新的道路，具有重要的意义，不仅为工业生产提供了新的策略，还让我们对细胞代谢和基因调控有了新的认识。
在这项研究中，研究人员用到了几个关键的技术方法。他们通过基因组编辑技术，将相关基因整合到酿酒酵母的基因组中；利用转录组分析技术，全面了解基因的表达情况；还运用了高效液相色谱（HPLC）分析等技术，对代谢产物进行检测和定量分析 ，从而深入探究 Rap1 过表达对酿酒酵母代谢的影响。
下面我们来看看具体的研究结果。
野生型酿酒酵母细胞中 Rap1 过表达的研究
- CEN.PK-Rap 菌株的构建及其对葡萄糖摄取、乙醇生产和 OSQ 合成的影响：研究人员想要过表达 Rap1，又不想让它产生毒性，于是选择了非糖酵解组成型启动子 CCW12 来驱动 Rap1 的过表达。他们构建了 CEN.PK-Rap 菌株，把PCCW12-RAP1-TRAP1 表达盒插入到野生型菌株 CEN.PK 2-1D 的基因组中。原本以为 Rap1 过表达会对糖酵解产生很大影响，从而改变葡萄糖摄取和乙醇生产，但研究人员培养这两种菌株并进行测量后发现，36 小时内，它们在细胞生长、葡萄糖摄取和乙醇生产方面并没有明显差异。不过，有趣的是，Rap1 过表达的菌株 OSQ 产量却显著增加，培养 36 小时后，OSQ 产量增加了 2 倍。这说明 Rap1 过表达虽然不影响葡萄糖利用，却能改变细胞的中心碳代谢（CCM），让 OSQ 产量上升。
- Rap1 过表达酵母细胞的全基因组转录组分析：根据之前的研究，Rap1 的基因靶点在二次生长转变（diauxic shift）后会扩大，所以研究人员在野生型 CEN.PK2-1D 和工程菌株 CEN.PK-Rap 的指数生长期（9 小时）、二次生长转变期（15 小时）和二次生长转变后期（36 小时）这三个不同阶段，进行了转录组分析。结果发现，在不同生长阶段，Rap1 过表达对基因转录的影响各不相同。在指数生长期，与碳代谢相关的基因表达没有明显差异，只有己糖转运蛋白基因（HXT1/2）和PDC5基因表达下调，但这并没有影响葡萄糖摄取和乙醇生产，因为有其他基因可以 “替补” 它们的功能。而到了二次生长转变期，Rap1 过表达菌株的多种己糖转运蛋白基因、糖酵解基因、PDH 旁路基因、TCA 循环基因等都上调了，这表明细胞利用底物的能力增强，丙酮酸向细胞质乙酰辅酶 A 的转化可能也增强了。到了二次生长转变后期，虽然一些己糖转运蛋白基因下调了，但 TCA 循环、糖异生相关基因以及甾醇生物合成基因等却上调了，这意味着 Rap1 过表达菌株通过非发酵碳源的分解代谢更活跃，还能增加 IPP、DMAPP 和 UDPG 的供应，有利于三萜皂苷的合成。
Rap1 过表达在 CK 生产菌株中的作用
- CK 生产菌株的构建：为了探究 Rap1 过表达的潜力，研究人员构建了能生产三萜皂苷 CK（ginsenoside compound K，具有抗过敏、抗疲劳、抗糖尿病、抗炎、抗癌和抗衰老等多种药理活性）的菌株。他们以之前构建的 CEN.PK-Met 菌株为基础，把 lanosterol synthase 基因（ERG7）的启动子换成了甲硫氨酸可抑制的 MET3 启动子，防止 OSQ 转化为 lanosterol。然后，将来自人参的 dammarenediol-II synthase（PgDS）、protopanaxadiol synthase（PgPPDS）、NADPH - 细胞色素 P450 还原酶（PgCPR）、UDP - 糖基转移酶 71A27（PgUGT71A27）以及酿酒酵母自身的 tHMGR1 和人参的 squalene epoxidase（PgSE）等基因的表达盒，在 TDH3 启动子的控制下，整合到 CEN.PK-Met 的染色体上，成功构建出了 CK 生产菌株 CK01。
- CK 生产菌株中 Rap1 过表达：研究人员构建了 CK01-TRap（整合PTDH3-RAP1-TRAP1 表达盒）和 CK01-CRap（整合PCCW12-RAP1-TRAP1 表达盒）菌株，来研究 Rap1 过表达在 CK 生产菌株中的作用。培养这几种菌株后发现，前期 CK 生产菌株的生长比亲本菌株慢，说明它们承受着代谢负担。但 24 小时后，过表达 Rap1 的 CK 生产菌株生长明显改善，72 小时后超过了亲本菌株。测量RAP1和TDH3的 mRNA 水平发现，TDH3 启动子驱动的 Rap1 表达更强，而且在葡萄糖耗尽后，TDH3的转录水平与 Rap1 转录水平成正比。培养 144 小时后，CK01-TRap 的 CK 产量最高，达到 18mg/L，相比 CK01 提高了 4.5 倍，CK01-CRap 的 CK 产量为 12mg/L，提高了 3 倍，这表明 TDH3 启动子更有利于提高 CK 产量。
- Rap1 过表达对 CK 生产中不可发酵碳源利用和异源基因表达的影响：研究人员还验证了 Rap1 过表达对 CK01-TRap 菌株利用非发酵碳源的影响。通过测量葡萄糖、乙醇、甘油和乙酸的消耗情况，发现 Rap1 过表达增强了菌株对甘油和乙醇的积累和消耗。测量 CK 中间产物发现，CK01-TRap 积累的除角鲨烯（SQ）外的中间产物更多，说明它能为 CK 合成途径持续提供充足的前体。此外，研究人员检测了 CK 合成相关基因的 mRNA 水平，发现除了tHMGR1基因外，其他基因的转录水平在 CK01-TRap 中提高了 2 倍，这表明 Rap1 过表达能上调大多数 CK 合成基因，进而提高 CK 产量。
在讨论部分，研究人员提到，之前对 Rap1 的研究大多是通过删除其结合位点来进行的，因为直接删除 Rap1 会导致细胞死亡。而 Rap1 过表达曾被认为会产生毒性，所以相关研究较少。但在这项研究中，用 CCW12 或 TDH3 启动子驱动 Rap1 过表达并没有对细胞生长产生负面影响。研究还发现，在指数生长期，Rap1 过表达对糖酵解基因的转录没有影响，因为此时 Rap1 的自然表达水平已经足够。而在二次生长转变后，Rap1 过表达能显著上调糖酵解基因，增强细胞利用替代碳源的能力。此外，Rap1 过表达还意外地影响了许多其他代谢途径相关基因的表达，这可能是它间接增加细胞质乙酰辅酶 A 供应的方式。虽然研究存在一些局限性，比如无法直接测量 ATP 和 NAD (P) H 水平，但 Rap1 过表达能上调许多与三萜皂苷生产相关的关键基因，这充分说明了这种方法的有效性。
总的来说，这项研究表明，Rap1 过表达策略可以普遍应用于其他三萜皂苷的生产。它不仅能促进由糖酵解启动子控制的三萜皂苷生物合成，增强中央碳代谢，还能提高细胞对非发酵碳源的摄取，促进 TCA / 乙醛酸循环，为细胞提供能量和辅助因子。而且，对于更长、更复杂的异源途径，Rap1 过表达的优势可能会更加明显。这一研究成果为工业生产三萜类化合物提供了新的思路和方法，让我们在生物制造的道路上又迈出了坚实的一步。
