过表达 Rap1：开启酿酒酵母高效生产三萜皂苷的新大门

为解决三萜皂苷生产难题，研究人员开展过表达 Rap1 提高其产量的研究。结果发现，Rap1 过表达可提升 CK 产量，还能增强前体供应与异源基因表达。这为工业生产三萜类化合物提供新途径，值得科研读者一读。

　　

在生物制造的奇妙世界里，有一种神奇的物质 —— 三萜皂苷（由一个 C30 的疏水三萜苷元和亲水糖基组成，具有杀虫、抗寄生虫、抗真菌、抗菌、抗癌、抗氧化和免疫刺激等多种生物活性 ），它在食品、化妆品和制药行业中备受青睐，就像一颗闪耀的明星。可这颗 “明星” 的获取却困难重重。从化学合成的角度看，三萜皂苷复杂的结构让合成过程如同攀登陡峭的山峰，难以逾越；从天然提取的途径来说，将其从天然来源中分离出来并得到纯化合物，也面临着诸多挑战，仿佛在茂密的丛林中寻找特定的一片叶子。

为了解决这些难题，科学家们把目光投向了微生物，尤其是有着 “一般认为安全”（GRAS）身份的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。酿酒酵母不仅能表达膜结合的真核细胞色素 P450 氧化酶（CYP450s，植物源产品如三萜类生物合成途径中的关键催化剂 ），产生的次生代谢产物还很少，而且它自身就有合成三萜皂苷关键前体 2,3 - 氧化角鲨烯（OSQ）的内源性途径，简直就是一个理想的 “生产工厂”。

然而，要让这个 “工厂” 高效生产三萜皂苷也并非易事。增加 OSQ 的产量是提高三萜皂苷产量的关键，此前研究发现，从葡萄糖合成 OSQ 需要经过糖酵解、丙酮酸脱氢酶（PDH）旁路、甲羟戊酸（MVA）途径和甾醇合成途径这四个 “关卡”。虽然已有研究分别对这四条途径进行了优化，但效果仍不尽人意。比如，在糖酵解途径中，调节少数基因对整体途径影响不大，即便过表达 13 个基因（共 18 个拷贝），效果也有待提升；在其他途径中，通过过表达或敲除少数限速基因虽有一定成效，但仍存在提升空间。

不仅如此，还有一个棘手的问题摆在科学家面前。在代谢工程中，通常会使用组成型启动子（如 TDH3、PGK1 或 PYK1，主要来源于糖酵解和核糖体蛋白启动子 ）来驱动基因表达，可这些启动子会共享有限的转录因子。过多使用这些启动子，就像很多人争抢有限的资源一样，会导致转录因子竞争，最终降低每个基因的转录水平。尤其是三萜皂苷的生物合成涉及多个酶促步骤，使用更多组成型启动子来表达这些异源基因，只会让问题变得更严重。

那有没有更好的办法呢？为了攻克这些难题，研究人员决定另辟蹊径。他们在《Microbial Cell Factories》期刊上发表了题为 “Overexpression of transcriptional factor Rap1 enhances triterpenoid saponin production in Saccharomyces cerevisiae” 的论文，找到了一种新策略 —— 过表达转录因子阻遏激活蛋白 1（Rap1）。研究发现，Rap1 不仅能上调糖酵解基因的表达，还参与了丙酮酸脱氢酶（PDH）旁路、甲羟戊酸（MVA）途径和甾醇合成等多种代谢途径。研究人员猜测，通过控制 Rap1 的过表达，或许能为三萜皂苷的生产带来新的转机。

在这项研究中，研究人员用到了几个关键技术方法。他们通过 CRISPR/Cas9 技术将RAP1基因整合到酿酒酵母的基因组中；利用转录组分析技术，在不同生长阶段对酵母细胞进行检测，了解基因表达的变化情况；采用高效液相色谱（HPLC）分析技术，对酵母细胞中的代谢产物进行定量分析。这些技术就像研究人员手中的 “魔法棒”，帮助他们一步步揭开 Rap1 过表达的奥秘。

下面来看看研究的具体成果。

野生型酿酒酵母细胞中 Rap1 过表达的研究

• CEN.PK - Rap 菌株的构建及其对葡萄糖摄取、乙醇生产和 OSQ 合成的影响：研究人员想用组成型启动子让 Rap1 过表达，同时又避免其产生毒性，于是选择了 CCW12 启动子（最强的非糖酵解组成型启动子之一 ）。他们构建了 CEN.PK - Rap 菌株，把P_CCW12-RAP1-T_RAP1盒插入到野生型菌株 CEN.PK 2 - 1D 的基因组中。原本以为 Rap1 过表达会影响糖酵解，进而影响葡萄糖摄取和乙醇生产，可研究发现，在 36 小时内，CEN.PK - Rap 菌株和野生型菌株在细胞生长、葡萄糖摄取和乙醇生产方面并没有明显差异。不过，让人惊喜的是，Rap1 过表达显著提高了 OSQ 的产量，培养 36 小时后，OSQ 产量增加了 2 倍。这就像在平静的湖面投下一颗石子，虽然没有引起预期的波澜，但却在另一个方面激起了水花。
• Rap1 过表达酵母细胞的全基因组转录组分析：根据 Buck 等人的研究，Rap1 的基因靶点在二次生长转变（diauxic shift）后会扩大。研究人员在野生型 CEN.PK2 - 1D 和工程菌株 CEN.PK - Rap 的指数生长期（9 小时）、二次生长转变期（15 小时）和二次生长转变后期（36 小时）进行转录组分析。结果发现，在不同生长阶段，Rap1 过表达对基因表达的影响各不相同。在指数生长期，除了己糖转运蛋白基因（HXT1/2）和PDC5基因表达下调外，与碳代谢相关的基因表达没有明显差异。但在二次生长转变期，Rap1 过表达菌株中与葡萄糖摄取相关的己糖转运蛋白基因（如HXT1、HXT6/7等 ）、糖酵解基因（如HXK1、GLK1等 ）、PDH 旁路基因（PDC1/6和ALD2/3）以及 TCA 循环相关基因（KGD2、SHH3/4/9等 ）的转录都上调了。到了二次生长转变后期，虽然一些己糖转运蛋白基因（HXT2/3/4/6/7/14/15/16）下调，但 TCA 和乙醛酸循环相关基因（CIT1/2/3、ACO1等 ）、甾醇生物合成基因（IDI和ERG10）以及与三萜皂苷合成相关的底物供应基因（PGM1和UGP1）的表达都上调了。这些结果表明，Rap1 过表达能广泛影响酿酒酵母的基因转录，改变碳代谢途径，增加从非发酵碳源（如乙醇、甘油和乙酸盐 ）和葡萄糖的碳通量，进而提高 OSQ 的产量，为三萜皂苷的生物合成提供更多原料。

Rap1 过表达在 CK 生产菌株中的作用

• CK 生产菌株的构建：为了探究 Rap1 过表达对三萜皂苷生产的影响，研究人员构建了能生产三萜皂苷 CK（ginsenoside compound K，具有抗过敏、抗疲劳、抗糖尿病、抗炎、抗癌和抗衰老等多种药理活性 ）的菌株。他们以 CEN.PK - Met 菌株为基础，替换了其中 lanosterol synthase 基因（ERG7）的启动子，阻止 OSQ 转化为 lanosterol。然后，将来自人参的 dammarenediol - II synthase（PgDS）、protopanaxadiol synthase（PgPPDS）、NADPH - cytochrome P450 reductase（PgCPR）和 UDP - glycosyltransferase 71A27（PgUGT71A27）以及酿酒酵母自身的 tHMGR1 和人参的 squalene epoxidase（PgSE）等基因，在 TDH3 启动子的控制下整合到染色体中，成功构建了 CK 生产菌株 CK01。
• CK 生产菌株中 Rap1 过表达：研究人员构建了 CK01 - TRap（整合P_TDH3-RAP1-T_RAP1盒 ）和 CK01 - CRap（整合P_CCW12-RAP1-T_RAP1盒 ）菌株，与 CK01 菌株进行对比研究。结果发现，在培养前期，CK 生产菌株的生长比亲本菌株慢，这可能是由于异源途径的整合带来了代谢负担。但在 24 小时后，Rap1 过表达的 CK 生产菌株（CK01 - CRap 和 CK01 - TRap）生长明显改善，72 小时后超过了亲本菌株。在 Rap1 表达方面，CK01 - TRap 和 CK01 - CRap 中的 Rap1 表达水平都显著高于 CK01，且 TDH3 启动子驱动的 Rap1 表达更强。在 CK 产量上，CK01 - TRap 产量最高（18 mg/L），是 CK01（4 mg/L）的 4.5 倍；CK01 - CRap 产量为 12 mg/L，是 CK01 的 3 倍，这表明 TDH3 启动子更有利于提高 CK 产量。
• Rap1 过表达对 CK 生产中不可发酵碳源利用和异源基因表达的影响：研究人员通过测量 CK01 - TRap 和 CK01 菌株对葡萄糖、乙醇、甘油和乙酸盐的消耗，发现 Rap1 过表达增强了菌株对甘油和乙醇的积累及消耗效率。同时，CK01 - TRap 菌株中除了角鲨烯（SQ）外，其他 CK 中间产物（如 OSQ、dammarenediol - II 和 protopanaxadiol ）的积累都更多，这说明 Rap1 过表达能为 CK 合成途径持续提供充足的前体。此外，Rap1 过表达还上调了大多数由 TDH3 启动子控制的 CK 合成基因的转录水平，进一步促进了 CK 的生产。这一系列结果表明，Rap1 过表达不仅能增加 OSQ 前体的供应，还能提高组成型启动子转录的异源基因的表达，从而有效提高三萜皂苷的产量。

研究人员通过对 Rap1 过表达的研究，发现这一策略可以促进由糖酵解启动子控制的三萜皂苷生物合成，增强中央碳代谢。在二次生长转变后，它能增加细胞对非发酵碳源的摄取，促进 TCA / 乙醛酸循环，为细胞生长、能量产生和三萜皂苷合成提供更多的能量和原料。而且，随着异源途径变得更长、更复杂，Rap1 过表达带来的优势可能会更加明显。这项研究为理解 Rap1 在细胞代谢和基因调控中的作用提供了新的视角，也为工业生产三萜类化合物开辟了一条可行的新途径，就像在黑暗中点亮了一盏明灯，为未来的生物制造研究指引了方向。