CCN2 或是膝关节纤维化 “幕后推手”，有望成关键诊疗新靶点

为解决膝关节纤维化（AF）致病机制不明、缺乏可靠生物标志物和治疗靶点的问题，上海交通大学附属第六人民医院的研究人员开展 AF 相关研究，发现 CCN2 或为潜在生物标志物，这为 AF 诊疗提供新方向，值得科研读者一读。

　　

在医学领域，膝关节纤维化（Knee arthrofibrosis，AF）就像一个隐藏在暗处的 “小怪兽”，给患者带来了不少麻烦。它主要表现为膝关节主动屈伸活动范围受限，而且不是由感染等特殊原因引起的。这一病症是常见的术后并发症，在进行前交叉韧带（Anterior cruciate ligament，ACL）重建手术后，有 2% - 35% 的患者会遭遇它；全膝关节置换术后，也有 0.2% - 10% 的患者会被它 “盯上”。在美国，每年差不多有 300 万患者要接受与 AF 相关的治疗，这不仅让患者承受身体上的痛苦，还带来了沉重的经济负担，比如全膝关节置换术后出现 AF 的患者，住院费用会比初次手术时多 7000 多美元。

为了战胜这个 “小怪兽”，医生和科研人员们一直在努力。目前，虽然关节松解手术（包括关节镜手术和开放手术）有了一定发展，但治疗效果仍不尽如人意。从病理角度来看，膝关节 AF 通常是手术或受伤引发的，它会打乱人体先天和适应性免疫反应，导致免疫细胞被激活，引发一系列促纤维化反应。不过，具体的致病机制还不明确。之前的研究虽然发现了一些与膝关节 AF 相关的生物途径和生物标志物，但大多停留在临床前阶段，因为技术限制，无法清晰地展示膝关节 AF 复杂的细胞景观，也难以阐明具体的分子机制，所以一直缺乏可靠的生物标志物和治疗靶点。

在这样的困境下，上海交通大学附属第六人民医院的研究人员决心揭开膝关节 AF 的神秘面纱。他们在《Nature Reviews Rheumatology》期刊上发表了名为《Identification of CCN2 as a potential biomarker for knee arthrofibrosis through single - cell transcriptome analysis》的论文。研究发现，通过对膝关节 AF 患者滑膜组织的单细胞转录组分析，发现了成纤维细胞 - 巨噬细胞通过 TGF - β 途径的相互作用，以及成纤维细胞中 CCN2 的自分泌回路，并且 CCN2 有望成为膝关节 AF 的新型生物标志物。这一发现为治疗膝关节 AF 带来了新的希望，就像在黑暗中找到了一丝曙光。

研究人员为了开展这项研究，运用了多种关键技术方法。他们首先通过流式细胞术（Flow cytometry，FCM）和单细胞 RNA 测序（Single - cell RNA sequencing，scRNA - seq）对滑膜组织进行分析，以此来了解其中的细胞组成和基因表达情况；接着使用 CellChat 分析细胞间的相互作用，挖掘细胞之间的 “交流秘密”；还通过 RNA 干扰技术抑制 CCN2 的表达，探究其对成纤维细胞功能的影响；最后利用免疫组织化学和免疫荧光染色等技术，在临床样本中验证 CCN2 的表达及其与膝关节 AF 的关系。

下面让我们详细看看研究人员的这些发现：

1. 绘制滑膜组织单细胞图谱：研究人员从 AF 患者和阴性对照（Negative controls，NC）患者身上获取滑膜组织，分别进行 FCM 和 scRNA - seq 分析。通过 FCM 分析发现，滑膜组织主要由 T 细胞、内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等组成。与 NC 组相比，AF 组的巨噬细胞和成纤维细胞数量增多，T 细胞和内皮细胞数量减少。scRNA - seq 分析则进一步将细胞分为成纤维细胞、巨噬细胞、成纤维样滑膜细胞（Fibroblast - like synoviocytes，FLS）、内皮细胞、血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMC）和 T 细胞 6 个不同的细胞群。这就像是给滑膜组织里的细胞们拍了一张 “大合照”，清晰地展示了不同细胞的 “面孔” 和数量变化。
2. 发现滑膜成纤维细胞的独特纤维化特征：成纤维细胞在膝关节 AF 中起着关键作用，正常情况下，它能维持组织的结构和平衡，但在纤维化疾病中却会 “捣乱”，产生过多的细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），促进纤维化。研究人员通过单细胞转录组分析，发现成纤维细胞可以分为三个亚群：DPP4?成纤维细胞（Fib1）、TNC?成纤维细胞（Fib2）和 APOD?成纤维细胞（Fib3）。AF 组中 Fib1 增多，Fib3 减少。而且，Fib1 和 Fib2 中与纤维化相关的基因表达较高，被认为是肌成纤维细胞，参与纤维化过程；Fib3 则在抗纤维化途径中富集，可能与纤维化关系不大。通过 RNA 速度分析还发现，Fib1 是细胞分化的主要来源，它可以向 Fib2 和 Fib3 分化。这一系列发现让我们对成纤维细胞在膝关节 AF 中的作用有了更深入的了解。
3. 识别滑膜巨噬细胞和其他滑膜细胞：巨噬细胞是促纤维化因子的重要来源，在膝关节 AF 中也非常重要，而且具有高度的可塑性和异质性。研究人员通过单细胞转录组分析，识别出三个巨噬细胞亚群：TREM2?巨噬细胞（Macro1）、TTN?巨噬细胞（Macro2）和 EGFR?巨噬细胞（Macro3）。AF 组中 Macro1 增多，Macro2 减少，Macro3 比例不变。进一步研究发现，Macro1 和 Macro2 属于 M1 巨噬细胞，参与先天免疫反应；Macro3 属于 M2 巨噬细胞，高表达促纤维化基因，可能在纤维化过程中与成纤维细胞进行 “交流”，发挥重要作用。此外，研究人员还对 FLS、内皮细胞和 VSMC 进行了分析，发现它们在 AF 中的变化和功能特点。这就像是揭开了巨噬细胞和其他滑膜细胞在膝关节 AF 中的 “秘密任务”。
4. 确定 CCN2 为膝关节 AF 的生物标志物：研究人员利用 CellChat 分析细胞间的相互作用，发现 AF 组中巨噬细胞与成纤维细胞的相互作用明显增强。进一步聚焦于促纤维化途径，发现 TGF - β 途径相关基因 CCN2 在 AF 组中表达显著升高，而且它位于潜在生物标志物基因和蛋白 - 蛋白相互作用网络的中心位置，因此被认为是膝关节 AF 的潜在生物标志物。这一发现就像找到了一把打开治疗膝关节 AF 大门的 “钥匙”。
5. 验证 CCN2 的功能和临床意义：为了探究 CCN2 的功能，研究人员使用小干扰 RNA（Small interfering RNA，siRNA）抑制 CCN2 的表达。结果发现，抑制 CCN2 后，TGF - β 诱导的成纤维细胞激活、增殖和迁移等促纤维化功能都受到了抑制，这表明 CCN2 在成纤维细胞的促纤维化过程中起着重要作用。在临床样本中，研究人员通过免疫荧光染色、H&E 染色、Masson 染色和免疫组化等方法进行验证。结果显示，AF 组的胶原沉积更多，CCN2 和 TGF - β 的表达更高，而且 CCN2 的表达与胶原体积、TGF - β 表达呈正相关，与膝关节功能评分呈负相关。这进一步证实了 CCN2 与膝关节 AF 的密切关系。

综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。它首次全面地对 ACL 重建后膝关节 AF 患者的滑膜组织进行单细胞转录组分析，清晰地呈现了其中的细胞组成和细胞间的相互作用。发现的成纤维细胞 - 巨噬细胞相互作用以及 CCN2 的自分泌回路，为我们理解膝关节 AF 的发病机制提供了新的视角。CCN2 作为潜在的生物标志物，不仅有助于更准确地诊断膝关节 AF，还可能成为未来精准治疗的靶点。虽然研究存在一些局限性，比如患者数量有限，还有其他因素未匹配等，但它依然为膝关节 AF 的研究和治疗开辟了新的道路，让我们离战胜这个 “小怪兽” 又近了一步。相信在未来，随着研究的不断深入，我们一定能找到更好的方法来治疗膝关节 AF，让患者摆脱病痛的折磨。