揭秘 BH3 - only 蛋白调控肝细胞凋亡机制，为肝脏健康研究带来新曙光

为明确 BH3 - only 蛋白在肝细胞凋亡中的作用，研究人员开展相关研究。结果发现 Puma 和 Noxa 等参与 Bak/Bax 依赖的肝细胞凋亡。该研究揭示了蛋白调控机制，对理解肝细胞稳态和凋亡相关疾病意义重大，推荐科研读者阅读。

　　

在细胞的世界里，肝细胞的生死平衡至关重要，而这背后有一群 “神秘的调控者”——Bcl-2 家族蛋白。这个家族分为两派，一派是抗凋亡（阻止细胞死亡）的成员，像 Bcl-x_L和 Mcl-1，它们努力维持着肝细胞的稳定；另一派则是促凋亡（促使细胞死亡）的成员，比如 Bak 和 Bax，它们就像细胞世界里的 “破坏分子”。当这两派的力量失衡时，肝细胞的命运就会受到影响。

在这个家族中，还有一类特殊的成员 ——BH3-only 蛋白，它有 8 个 “小伙伴”，分别是 Bid、Bim、Puma、Noxa、Bad、Bmf、Bik 和 Hrk。这些蛋白是细胞凋亡的 “启动器”，一旦被激活，就会引发一系列反应，最终激活 Bak/Bax，导致细胞凋亡。虽然科学家们对它们的作用机制进行了大量研究，但关于它们如何在体内，特别是在肝细胞中激活 Bak/Bax，还存在很多疑问。

之前的研究发现，肝细胞特异性敲除 Mcl-1 或 Bcl-x_L的小鼠会出现自发的肝细胞凋亡，而且 Bak 或 Bax 敲除可以抑制这种凋亡，这表明这种凋亡依赖于 Bak 和 Bax。同时，研究还发现 Bid 和 Bim 在其中起到了重要作用，但其他 BH3-only 蛋白的作用还不清楚。为了深入了解这些蛋白在肝细胞凋亡中的作用，来自 作者[第一作者单位] 的研究人员决心一探究竟。他们的研究成果发表在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》期刊上，论文题目是《BH3-only proteins Puma and Noxa contribute to Bak/Bax-dependent hepatocyte apoptosis in the absence of Mcl-1 and Bcl-xL》。研究人员发现，在 8 个 BH3-only 蛋白中，Puma 和 Noxa 与 Bid 和 Bim 一样，都参与了在缺乏抗凋亡 Bcl-2 家族蛋白时，Bak/Bax 依赖的肝细胞凋亡过程，但它们并不是不可或缺的。这项研究揭示了 BH3-only 蛋白在小鼠肝脏中的协同作用，为深入理解肝细胞的生死调控机制提供了重要线索。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是基因编辑技术，通过构建各种基因敲除小鼠模型，如 Puma 敲除小鼠、Noxa 敲除小鼠等，来观察特定基因缺失对肝细胞凋亡的影响；其次是蛋白质检测技术，像 Western blotting 分析，用于检测细胞和组织中蛋白质的表达水平；还有 RNA 干扰技术，利用 siRNA 介导的基因沉默，来研究特定基因在细胞凋亡过程中的功能。

下面我们来看看具体的研究结果：

1. Disruption of Puma suppresses hepatocyte apoptosis in mice with hepatocyte-specific knockout of Bcl-x_L or Mcl-1：研究人员将 Mcl-1^ΔHep/ΔHep小鼠或 Bcl-x_L^ΔHep/ΔHep小鼠与 Puma 敲除小鼠进行杂交，得到了 Mcl-1^ΔHep/ΔhepPuma^?/?小鼠和 Bcl-x_L^Δhep/ΔhepPuma^?/?小鼠。通过检测血清 ALT 水平、血清 caspase 3/7 活性、TUNEL 阳性肝细胞数量以及活性 Bax 的表达水平，发现 Mcl-1^ΔHep/ΔHepPuma^?/?小鼠和 Bcl-x_L^ΔHep/ΔHepPuma^?/?小鼠的这些指标都明显低于 Mcl-1^ΔHep/ΔHep小鼠和 Bcl-x_L^ΔHep/ΔHep小鼠。这表明 Puma 参与了在缺乏抗凋亡 Bcl-2 家族蛋白时，通过激活 Bak/Bax 来执行肝细胞凋亡的过程。
2. Disruption of Bid, Bim and Puma cannot fully suppress hepatocyte apoptosis induced by the deletion of Bcl-x_L and Mcl-1：研究人员又研究了敲除 Bid、Bim 和 Puma 是否能完全阻止在缺乏 Bcl-x_L和 Mcl-1 时的肝细胞凋亡。他们发现，敲除这三个基因并不能降低 Bcl-x_L^ΔHep/ΔHepMcl-1^ΔHep/ΔHep小鼠的死亡率。对于 Bcl-x_L^ΔHep/ΔHepMcl-1^ΔHep/+小鼠，敲除 Bid 和 Bim 可以减少血清 ALT 水平和 TUNEL 阳性肝细胞数量，但仍存在肝细胞凋亡。额外敲除 Puma 可以进一步降低这些指标，但 Bcl-x_L^ΔHep/ΔHepMcl-1^ΔHep/+Bid^?/?Bim^?/?Puma^?/?小鼠的血清 ALT 水平和肝脏组织中活性 Bax 的表达仍高于 Bcl-x_L^ΔHep/ΔHepMcl-1^ΔHep/+Bax^ΔHep/ΔHepBak^?/?小鼠。此外，他们还构建了 tamoxifen 诱导的 Bcl-x_L^{iΔHep/iΔHep}Mcl-1^{iΔHep/iΔHep}Bid^?/?Bim^?/?Puma^?/?小鼠模型，发现注射 tamoxifen 后，这些小鼠仍出现肝细胞凋亡。这说明除了 Bid、Bim 和 Puma，可能还有其他 BH3-only 蛋白参与了在缺乏 Bcl-x_L和 Mcl-1 时激活 Bak/Bax 并诱导肝细胞凋亡的过程。
3. Noxa knockdown suppresses apoptosis in Bcl-x_L-, Mcl-1-, Bid-, Bim- and Puma-deficient hepatocytes：为了寻找其他参与肝细胞凋亡的 BH3-only 蛋白，研究人员构建了一个 doxycycline 诱导的 Bcl-x_L^{iΔHep/iΔHep}Mcl-1^{iΔHep/iΔHep}Bid^?/?Bim^?/?Puma^?/?肝细胞系。在这个细胞系中，他们发现 Bik 和 Hrk 不表达，而 Noxa、Bad 和 Bmf 表达。用 doxycycline 处理后，只有 Noxa 的表达增加。通过 siRNA 介导的基因沉默实验，发现敲低 Noxa 可以显著降低 Bax 激活、Caspase 3/7 活性、LDH 活性和 Annexin V 阳性区域，同时显著增加相对细胞活力，而敲低 Bad 或 Bmf 则没有这些效果。这表明 Noxa 在 Bcl-x_L、Mcl-1、Bid、Bim 和 Puma 缺陷的肝细胞凋亡中起到了重要作用。
4. Disruption of Noxa decreases hepatocyte apoptosis in Bcl-x_L Mcl-1-, Bid-, Bim- and Puma-deficient mice and Mcl-1-deficient mice：研究人员在体内进一步研究 Noxa 的作用，通过 CRISPR-Cas9 技术构建了 tamoxifen 诱导的 Bcl-x_L^{iΔHep/iΔHep}Mcl-1^{iΔHep/iΔHep}Bid^?/?Bim^?/?Puma^?/?Noxa^?/?小鼠模型。结果发现，敲除 Noxa 可以显著降低 tamoxifen 处理后的 Bcl-x_L^{iΔHep/iΔHep}Mcl-1^{iΔHep/iΔHep}Bid^?/?Bim^?/?Puma^?/?小鼠的血清 ALT 水平、caspase 3/7 活性、TUNEL 阳性肝细胞数量，并抑制 Bax 激活，还能显著延长小鼠的生存时间。在 Mcl-1^ΔHep/ΔHep小鼠中敲除 Noxa，也能降低血清 ALT 水平、血清 caspase 3/7 活性，减少 TUNEL 阳性肝细胞数量和活性 Bax 的表达。这进一步证明了 Noxa 在肝细胞凋亡中的重要作用。
5. No BH3-only proteins other than Bid, Bim, Puma and Noxa contribute to hepatocyte apoptosis caused by the deletion of both Mcl-1 and Bcl-x_L：研究人员构建了 doxycycline 诱导的 Bcl-x_L^{iΔHep/iΔHep}Mcl-1^{iΔHep/iΔHep}Bid^?/?Bim^?/?Puma^?/?Noxa^?/?肝细胞系，发现敲低 Bad 或 Bmf 对 Bax 激活、caspase 3/7 活性、LDH 活性和相对细胞活力没有影响，而敲低 Bak 和 Bax 则可以完全消除这些指标的变化。此外，通过 RNA-seq 分析，他们还发现了一些与凋亡相关的基因，如 Caspase-6、Caspase-9 和 Caspase-12，但敲低 Caspase-6 对 caspase 3/7 活性没有影响，只是略微增加了相对细胞活力。这表明除了 Bid、Bim、Puma 和 Noxa，其他 BH3-only 蛋白似乎不参与在缺乏 Mcl-1 和 Bcl-x_L时的肝细胞凋亡过程，同时也暗示可能存在其他未知的调控机制。

综合研究结果和讨论部分，研究人员发现 Puma 和 Noxa 与 Bid 和 Bim 一样，都参与了在缺乏抗凋亡 Bcl-2 家族蛋白时，Bak/Bax 依赖的肝细胞凋亡过程。然而，敲除所有这些蛋白并不能完全阻止肝细胞凋亡，这表明可能存在一种不依赖于 BH3-only 蛋白的 Bak/Bax 激活机制，也许是之前报道的线粒体外膜激活 Bax 的机制在起作用，当然也不能排除存在尚未被发现的直接激活 Bak/Bax 的 BH3-only 蛋白。此外，研究人员还发现 caspase-6 可能在肝细胞凋亡中起到一定作用，但具体机制还需要进一步研究。

这项研究意义重大，它让我们对肝细胞中 Bcl-2 家族蛋白的调控机制有了更深入的了解。就像为我们打开了一扇通往肝细胞世界的新大门，让我们看到了细胞生死平衡背后复杂而精妙的调控网络。这不仅有助于我们理解肝细胞的正常生理功能，还为研究肝脏相关疾病的发病机制和治疗策略提供了重要的理论依据，为未来攻克肝脏疾病带来了新的希望。