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为明确 8 种 BH3-only 蛋白在 Bak/Bax 依赖的肝细胞凋亡中的作用，研究人员开展相关研究。结果发现 Puma 和 Noxa 参与其中，但并非不可或缺，还存在非依赖 BH3-only 蛋白的激活机制。该研究有助于理解肝细胞稳态和凋亡相关疾病，值得一读。
在细胞的世界里，肝细胞的生存与凋亡（细胞程序性死亡）就像一场微妙的平衡游戏，而 Bcl-2 家族蛋白则是这场游戏的关键参与者。其中，抗凋亡蛋白 Bcl-xL 和 Mcl-1 就像细胞的 “守护者”，努力维持着肝细胞的完整性；促凋亡蛋白 Bak 和 Bax 则像是 “破坏者”，一旦被激活，就会引发肝细胞凋亡。而 BH3-only 蛋白家族，这个由 Bid、Bim、Puma、Noxa、Bad、Bmf、Bik 和 Hrk 这 8 名成员组成的 “神秘组织”，更是凋亡过程中的 “启动器”，它们在接收到各种刺激信号后，会激活 Bak/Bax，从而开启细胞凋亡的 “大门”。
过去的研究已经发现，在肝细胞中，当抗凋亡蛋白 Bcl-xL 和 / 或 Mcl-1 缺失时，Bid 和 Bim 会通过激活 Bak/Bax，推动肝细胞走向凋亡。然而，就像神秘的拼图还缺了很多关键碎片一样，这 8 种 BH3-only 蛋白在 Bak/Bax 依赖的肝细胞凋亡过程中究竟是如何全面发挥作用的，仍然是一个未解之谜。这就好比在黑暗中摸索，虽然看到了一丝光亮，但周围大部分还是未知。科学家们深知，搞清楚这个问题对于理解肝细胞的正常生理功能以及相关疾病的发生机制至关重要。所以，为了揭开这个谜团，作者[第一作者单位] 的研究人员展开了深入的探索，并在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》期刊上发表了题为《BH3-only proteins Puma and Noxa contribute to Bak/Bax-dependent hepatocyte apoptosis in the absence of Mcl-1 and Bcl-xL》的论文。研究人员最终发现，在这 8 种 BH3-only 蛋白中，除了 Bid 和 Bim，Puma 和 Noxa 也参与了因 Mcl-1 和 Bcl-xL 缺失导致的 Bak/Bax 依赖的肝细胞凋亡过程，但它们并非是不可或缺的。这一发现就像在黑暗中点亮了一盏明灯，为我们理解肝细胞凋亡机制提供了重要的线索。
为了完成这项研究，研究人员主要运用了基因编辑技术、细胞培养与处理技术以及多种检测分析技术。通过基因编辑技术，对小鼠的相关基因进行敲除或修饰，构建出各种基因编辑小鼠模型；利用细胞培养与处理技术，培养小鼠原代肝细胞并进行永生化处理，同时对细胞进行转染、药物处理等操作；借助多种检测分析技术，如定量实时 RT-PCR 分析、Western blotting 分析、免疫沉淀等，来检测基因表达水平、蛋白表达与活性等指标，从而深入探究 BH3-only 蛋白在肝细胞凋亡中的作用。
研究人员首先关注了 Puma 在肝细胞凋亡中的角色。他们通过将 Mcl-1ΔHep/ΔHep 小鼠或 Bcl-xLΔHep/ΔHep 小鼠与 Puma 基因敲除（Puma?/?）小鼠进行杂交，得到了 Mcl-1ΔHep/ΔhepPuma?/?小鼠和 Bcl-xLΔhep/ΔhepPuma?/?小鼠。经过一系列检测发现，与 Mcl-1ΔHep/ΔHep 小鼠和 Bcl-xLΔHep/ΔHep 小鼠相比，Mcl-1ΔHep/ΔhepPuma?/?小鼠和 Bcl-xLΔhep/ΔhepPuma?/?小鼠的血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平更低，血清 caspase 3/7 活性也更低，并且肝脏中 TUNEL 阳性的肝细胞数量明显减少，活性 Bax 的表达水平也降低了。这一系列结果表明，BH3-only 蛋白 Puma 参与了在抗凋亡 Bcl-2 家族蛋白缺失情况下，通过激活 Bak/Bax 来执行肝细胞凋亡的过程。
接着，研究人员想知道敲除 Bid、Bim 和 Puma 是否能完全阻止在 Bcl-xL 和 Mcl-1 缺失时肝细胞的凋亡。他们发现，Bcl-xLΔHep/ΔHepMcl-1ΔHep/ΔHep 小鼠和 Bcl-xLΔHep/ΔHepMcl-1ΔHep/+ 小鼠肝脏发育都存在缺陷，且前者出生后一天内全部死亡，敲除 Bid、Bim 和 Puma 并不能降低其死亡率。在 Bcl-xLΔHep/ΔHepMcl-1ΔHep/+ 小鼠中，虽然敲除 Bid 和 Bim 能降低血清 ALT 水平和 TUNEL 阳性肝细胞数量，但仍存在肝细胞凋亡现象。进一步敲除 Puma 后，血清 ALT 水平、血清 caspase 3/7 活性、TUNEL 阳性肝细胞数量以及活性 Bax 的表达都显著降低，但与 Bcl-xLΔHep/ΔHepMcl-1ΔHep/+BaxΔHep/ΔHepBak?/?小鼠相比，Bcl-xLΔHep/ΔHepMcl-1ΔHep/+Bid?/?Bim?/?Puma?/?小鼠的血清 ALT 水平和肝脏组织中活性 Bax 的表达仍然较高。此外，研究人员还构建了他莫昔芬诱导的 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBid?/?Bim?/?Puma?/?小鼠模型，结果发现，注射他莫昔芬后，这些小鼠出现血清 ALT 水平升高、caspase 3/7 活性增强、TUNEL 阳性肝细胞增多以及肝脏组织中检测到活性 Bax 等现象，且所有小鼠在注射他莫昔芬后 4 天内全部死亡。而 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBaxiΔHep/iΔHepBak?/?小鼠在注射他莫昔芬后血清 ALT 水平无明显变化，且全部存活至第 6 天。这些结果说明，除了 Bid、Bim 和 Puma，可能还有其他 BH3-only 蛋白在 Bcl-xL 和 Mcl-1 缺失时激活 Bak/Bax 并诱导肝细胞凋亡。
为了找出其他可能参与肝细胞凋亡的 BH3-only 蛋白，研究人员利用永生化的原代小鼠肝细胞，构建了一种强力霉素诱导的 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBid?/?Bim?/?Puma?/?肝细胞系。经过培养处理后发现，在剩余的 5 种 BH3-only 蛋白中，Noxa、Bad 和 Bmf 在该细胞系中表达，而 Bik 和 Hrk 未被检测到。并且，经过强力霉素处理后，只有 Noxa 的表达增加。进一步用 siRNA 介导敲低 Noxa 后，细胞中 Bax 激活、caspase 3/7 活性、LDH 活性以及 Annexin V 阳性区域都显著降低，细胞相对活力显著增加；而敲低 Bad 或 Bmf 则没有这些效果。这表明 Noxa 在 Bcl-xL、Mcl-1、Bid、Bim 和 Puma 缺失的肝细胞凋亡过程中起到重要作用。
研究人员在体内也验证了 Noxa 的作用。他们通过 CRISPR-Cas9 技术敲除 Noxa，构建了他莫昔芬诱导的 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBid?/?Bim?/?Puma?/?Noxa?/?小鼠模型。结果显示，敲除 Noxa 显著降低了经他莫昔芬处理的 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBid?/?Bim?/?Puma?/?小鼠的血清 ALT 水平、caspase 3/7 活性，减少了 TUNEL 阳性肝细胞数量，抑制了 Bax 的激活，并且延长了小鼠的存活时间。此外，在 Mcl-1ΔHep/ΔHep 小鼠中敲除 Noxa，与 Mcl-1ΔHep/ΔHep 小鼠相比，Mcl-1ΔHep/ΔHepNoxa?/?小鼠的血清 ALT 水平和血清 caspase 3/7 活性更低，肝脏切片中 TUNEL 阳性肝细胞更少，肝脏组织中活性 Bax 的表达水平也更低。这些体内实验结果充分证明了 Noxa 在肝细胞凋亡过程中的重要作用。
研究人员还想知道除了 Bid、Bim、Puma 和 Noxa，其他 BH3-only 蛋白是否参与了肝细胞凋亡。他们构建了强力霉素诱导的 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBid?/?Bim?/?Puma?/?Noxa?/?肝细胞系，结果发现，经强力霉素处理后，细胞的 caspase 3/7 活性和 LDH 活性显著增加，细胞相对活力显著降低，且仍能检测到活性 Bax。虽然 Bad 和 Bmf 在细胞中表达，且经强力霉素处理后其 mRNA 表达水平增加，但用 siRNA 介导敲低这两个基因，对细胞中 Bax 激活、caspase 3/7 活性、LDH 活性以及细胞相对活力都没有影响。相反，敲低 Bak 和 Bax 则完全消除了 caspase 3/7 活性和 LDH 活性的增加，并且提高了细胞活力。这就明确表明，除了 Bid、Bim、Puma 和 Noxa，其他 BH3-only 蛋白不参与因 Mcl-1 和 Bcl-xL 缺失导致的肝细胞凋亡过程。
研究人员还对强力霉素诱导的 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBid?/?Bim?/?Puma?/?Noxa?/?永生化肝细胞系和 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBid?/?Bim?/?Puma?/?Noxa+/+ 永生化肝细胞系进行了 RNA 测序，以探索 Bid、Bim、Puma 和 Noxa 之外参与肝细胞凋亡的其他分子。RNA 测序分析发现了一些与凋亡相关的基因，如 Caspase-6、Caspase-9 和 Caspase-12，研究人员重点研究了 Caspase-6。通过 siRNA 介导敲低 Caspase-6，发现其能略微但显著提高经强力霉素处理的 Bcl-xLiΔHep/iΔHepMcl-1iΔHep/iΔHepBid?/?Bim?/?Puma?/?Noxa?/?细胞的相对活力，但对 caspase 3/7 活性没有影响。这说明 Caspase-6 可能在肝细胞凋亡过程中发挥一定作用，但具体机制还需要进一步研究。
综合上述研究结果，研究人员得出结论：在 8 种 BH3-only 蛋白中，Puma 和 Noxa 与 Bid 和 Bim 一样，都参与了因抗凋亡分子缺失导致的 Bax/Bak 依赖的肝细胞凋亡过程，但它们并非是不可或缺的。同时，研究数据还表明存在一种不依赖于 BH3-only 蛋白的 Bak/Bax 激活机制。这项研究意义重大，它揭示了 BH3-only 蛋白在小鼠肝脏中的协同作用，让我们对肝细胞中 Bcl-2 家族蛋白的调控机制有了更深入的了解。这不仅有助于我们理解肝细胞的正常生理稳态维持机制，还为研究肝细胞凋亡相关疾病的发病机制提供了重要的理论依据，为未来开发相关疾病的治疗方法指明了新的方向。就像为肝细胞凋亡机制这座大厦添砖加瓦，让我们朝着攻克相关疾病的目标又迈进了一步。
