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为明确韩国罕见 SCAs 患病率及诊断难题，三星医疗中心和首尔国立大学医院的研究人员开展 SCA10、12、31 和 36 的相关研究。结果发现 SCA36 在特定人群中有一定占比，LRS 有诊断潜力。推荐阅读，助您了解前沿成果。
在神秘的医学领域中，有一种被称为脊髓小脑共济失调（Spinocerebellar ataxias，SCAs）的疾病，它如同隐藏在身体里的 “捣乱分子”，是一类神经退行性疾病。患者的小脑会逐渐受到侵害，导致进行性的共济失调，简单来说，就是患者的身体协调性会越来越差，走路摇摇晃晃，就像喝醉酒一样，连一些简单的动作，比如拿杯子、写字，对他们来说都变得困难重重。
目前，已知的 SCAs 有五十种之多，其中十二种是由重复序列扩增引起的。在全球范围内，SCA3 是最常见的亚型。但 SCAs 的分布可有点 “任性”，它在不同的种族和地区，患病率差异很大。在韩国，之前的研究发现 SCA2 或 SCA3 是当地最常见的亚型。
不过，关于 SCAs 的诊断和认知，还存在不少 “绊脚石”。一方面，全面检测 SCAs 面临着成本和劳动力的限制，使得人们对 SCAs 的了解并不完整。另一方面，一些 SCAs 的诊断难度较大，比如某些 SCAs 存在长重复序列扩增，传统的荧光扩增片段长度 PCR（AL-PCR）在检测含有大量重复数的扩增等位基因时，常常 “力不从心”，无法成功扩增。虽然重复引物 PCR（RP-PCR）能在一定程度上解决这个问题，但对于像 SCA10 和 SCA36 这类疾病，RP-PCR 出现的锯齿状模式也很难判断是真正的突变还是意义不确定的等位基因。以前，人们只能依靠复杂又费力的 Southern 印迹技术来区分，但这种技术在临床应用中困难重重。
随着科技的发展，新一代测序技术（NGS）出现了，它大大提升了诊断能力。不过，对于超过读取长度的重复序列进行准确测量，NGS 也 “束手无策”。而长读长测序技术（Long-read sequencing，LRS），像是单分子实时（SMRT）测序、牛津纳米孔技术（ONT），凭借其长读长的优势，能实现对单 DNA 分子的实时测序，在诊断各种遗传疾病，包括重复序列扩增疾病方面，展现出了巨大的潜力。
在韩国，大多数常规诊断实验室在检测 SCAs 时，通常只关注 SCA1、2、3、6、7、8 和 17 这些常见类型，这就导致一些不太常见的 SCAs，如 SCA10、12、31 和 36 的患病率一直不太清楚。为了填补这些知识 “空白”，来自三星医疗中心和首尔国立大学医院的研究人员在《European Journal of Human Genetics》期刊上发表了一篇名为 “Prevalence of spinocerebellar ataxias 10, 12, 31, and 36 in South Korea: a molecular analysis using long-read sequencing” 的论文。他们通过研究，有了不少重要发现，这些发现对提高 SCAs 的诊断效率意义重大。
研究人员在这项研究中，主要运用了几种关键技术方法。首先是 PCR 技术，针对不同的基因位点（SCA10、12、31 和 36），根据其完全外显等位基因的重复范围和重复结构，采用了不同的 PCR 策略。比如，对于 SCA12，若 AL-PCR 检测到纯合性，就用 RP-PCR 来确认是否存在未扩增的扩增等位基因；对于 SCA10 和 SCA36，除了上述操作，还需要估计扩增等位基因的重复数，以此区分致病性和意义不确定的等位基因。其次，利用 LRS 技术来确定 SCA36 扩增等位基因的准确重复数。研究人员借助 ONT 平台，对目标区域进行富集，再通过一系列的操作，最终得到准确的重复数信息。
下面，我们来看看研究人员都有哪些重要发现。
- 未确诊小脑性共济失调患者（队列 1）中 SCA10、12、31 和 36 的筛查结果：研究人员招募了队列 1，这里面有 78 名小脑性共济失调患者，他们来自 67 个家庭，之前经过常见遗传性共济失调检测都没有确诊。研究人员对他们进行 SCA10、12、31 和 36 的筛查。结果发现，SCA31 在 PCR 扩增和 HaeIII 酶切消化后没有观察到插入；SCA10、12 和 36 通过 AL-PCR 检测的杂合率分别为 77%（60/78）、81%（63/78）和 50%（39/78）。在 SCA10 和 SCA12 中，即使对显示纯合性的病例进行 RP-PCR，也没有观察到锯齿状模式。但在 SCA36 的检测中，有 10 名患者（来自 8 个家庭）的 RP-PCR 出现了锯齿状模式，这表明他们存在超出正常重复范围的扩增等位基因，这个比例占到未确诊小脑性共济失调家庭的 11.9%。
- 未选择的共济失调患者（队列 2）中 SCA36 的患病率：由于队列 1 中 SCA36 的阳性率出乎意料地高，研究人员又对队列 2 进行了研究。队列 2 是从 2011 年 1 月到 2022 年 2 月，在三星医疗中心进行常见 SCAs 基因检测的患者。这里面有 99 个样本，经过检测，12 个样本（12.1%）被诊断为常见的 SCAs，剩下 87 个未确诊为常见 SCAs 的样本进行了 SCA36 的 AL-PCR 和 RP-PCR 检测，结果发现有 1 个样本（ATA - 109）的 RP-PCR 出现锯齿状模式，占未选择的共济失调患者的 1.0%。
- 使用 LRS 确认 SCA36：在 11 名（队列 1 有 10 名，队列 2 有 1 名）SCA36 的 RP-PCR 出现锯齿状模式的患者中，有 7 名（队列 1 有 6 名，队列 2 有 1 名）进行了 LRS 检测。检测发现，目标区域的覆盖深度在 46 - 845X 之间，估计的重复数在 537 - 1403 之间，而且这些扩增等位基因在 4.2 kb 区域内显示出相同的单倍型。不过，由于 DNA 的可用性限制，剩下的患者无法进行 LRS 检测。
- 韩国 SCA36 患者的临床特征：研究人员还将韩国的 SCA36 患者与之前国际研究中的 SCA36 患者进行了临床特征对比。他们发现，在检查年龄、发病年龄和性别方面，两组没有差异。但在临床特征上，韩国患者的腱反射亢进（Hyperreflexia）频率比全球患者更高（100% vs. 56.3%）。
在研究结论和讨论部分，研究人员发现 SCA36 在未确诊的小脑性共济失调家庭（队列 1）中有 11.9% 的比例，在未选择的共济失调患者（队列 2）中有 1.0% 的比例，这说明 SCA36 很可能在韩国人群中被低估了，主要原因就是缺乏方便的诊断方法。而且，韩国 SCA36 患者有独特的临床特征，腱反射亢进更为常见。
从全球范围来看，SCA36 在不同地区的患病率差异很大。在一些地区，如西班牙的加利西亚地区、日本和中国，SCA36 的患病率相对较高；但在德国、希腊和葡萄牙等一些欧洲国家，却没有检测到 SCA36。在本研究中，队列 1 中 SCA36 的高频率可能是因为排除了其他常见的 SCAs，而且部分患者经过外显子组测序排除了其他遗传疾病，还有部分患者有共济失调家族史。队列 2 的患病率与日本和中国的研究结果有些相似，但由于队列 2 可能不能很好地代表韩国的共济失调患者，还需要更多的研究来确定。另外，研究中所有患者在 4.2 kb 区域内具有相同的单倍型，这可能暗示患者之间存在遗传相关性，但还需要更深入的研究来证实。
此外，研究人员没有发现 SCA10、12 和 31 的患者，这和之前的研究结果一致。SCA10 在秘鲁、墨西哥等一些地区比较常见，但在其他地方很少见；SCA12 主要集中在印度北部的一个族群；SCA31 在日本较为常见，在韩国、中国台湾和中国大陆等地则很少见。
LRS 技术在诊断重复序列扩增疾病方面虽然很有前景，但也面临一些挑战。比如数据解读复杂、覆盖深度问题、成本高以及可及性有限等。而且，在本研究中，部分患者的重复数低于传统 Southern 印迹法认为的致病阈值 650 次，但依然出现了 SCA36 的症状，这可能是技术差异导致的，也可能意味着低于 650 次重复也可能致病。未来，还需要进一步研究来明确重复序列扩增引发疾病的阈值，规范重复序列测量方法，提高测序准确性。
这项研究也存在一些不足之处。有些患者因为残疾严重，无法进行全面检查；部分疑似 SCA36 的患者由于 DNA 量少或质量差，无法进行 LRS 检测；队列 1 可能存在抽样偏差，队列 2 的样本缺乏详细的临床特征描述。
不过，总体来说，这项研究意义重大。它让我们对韩国人群中 SCA10、12、31 和 36 的患病率有了更清晰的认识，尤其是 SCA36。研究还表明，将 LRS 技术纳入 SCAs 的常规诊断流程，有望提高诊断效率，特别是对于像韩国这样 SCA36 患病率较高的人群。这也提醒医疗专业人员要更加关注 SCA36，以便能更早地诊断和治疗患者，改善患者的生活质量。
