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为解决传统蛋白质检测技术不适合即时检测（POC）及现有 POC 检测开发时间长的问题，美国麻省理工学院研究人员开展 TLISA（T7 RNA 聚合酶 - 连锁免疫传感测定）平台研究，该平台可快速检测多种蛋白质，有望推动 POC 检测发展。
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一、研究背景
在疾病管理与治疗中，尽早诊断疾病至关重要。然而，当前多数临床诊断的金标准检测方法，如高效液相色谱（HPLC）、质谱法、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）以及酶联免疫吸附测定（ELISA）等，存在诸多局限性。这些方法不仅依赖昂贵的设备，还需要专业技术人员在设备精良的实验室中操作，这使得它们难以广泛普及，尤其在医疗资源匮乏的地区和低收入国家，民众难以获得高质量的医疗检测服务。
即时检测（POC）工具的出现，为解决这一问题带来了希望。POC 检测能提高检测的可及性，有助于疾病的早期发现、制定更理想的治疗方案，进而改善患者的预后。但现有的 POC 平台，如侧向流动分析（LFA），在重新配置以检测新目标时面临挑战，其设计参数复杂且相互关联，需要反复优化，这极大地限制了其应用范围。
细胞无细胞表达（CFE）系统是一种极具潜力的 POC 诊断技术平台。它由细胞裂解物、底物和能源等简单成分组成，可在体外实现从 DNA 模板的转录和翻译过程。CFE 系统具有诸多优势，如可冻干处理以便在常温下长期保存，能在少量人体样本基质中有效反应，还可产生比色输出，便于在无设备的情况下解读结果，且每次反应成本仅为 0.02 - 0.04 美元。尽管 CFE 系统在检测核酸、离子和小分子生物标志物方面取得了不少成果，但在蛋白质检测领域仍存在不足。蛋白质作为许多疾病的金标准生物标志物，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的 100 多种诊断测试的目标，但目前利用 CFE 进行蛋白质模块化检测的技术还不够成熟。
此前虽有一些利用 CFE 进行模块化蛋白质传感的尝试，但大多使用适体（能与特定目标高亲和力结合的寡核苷酸）来调节蛋白质识别时的基因表达。然而，新进化或合成适体的模块化实施面临诸多困难，将其整合到现有传感平台通常需要通过昂贵且耗时的反复试验。此外，现有的基于适体的 CFE 生物传感器存在诸多缺陷，如无法与视觉比色输出关联、未在人体样本中测试、不能冻干储存和运输等，这些都使其无法满足 POC 检测的需求。
为了填补这一空白，美国麻省理工学院的研究人员开展了一项重要研究，旨在开发一种新型的蛋白质检测平台。
二、研究方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
- 构建融合蛋白：将纳米抗体（NBs）或其他亲和结构域分别与分裂的 T7 RNA 聚合酶（T7RNAP）片段融合，构建 TLISA 平台。其中，T7RNAP 的一个片段（T7RNAP<sub>Nev</sub>）经过进化，在无强制共定位时自发重组极少，而目标抗原可通过与融合在聚合酶片段上的亲和结构域结合，促使 T7RNAP 重组。
- 质粒制备与细胞培养：通过 Gibson Assembly 或平端连接等方法，将相关基因构建到质粒中，并利用大肠杆菌（E. coli）菌株进行质粒的克隆和制备。同时，制备用于实验的细胞无细胞裂解物。
- TLISA 反应及检测：进行 TLISA 反应，包括预表达反应和最终传感反应。通过监测 β - 半乳糖苷酶（LacZ）催化底物产生的颜色变化，利用吸光度测量来评估传感器的功能，并使用面积曲线下的面积（ABC）作为衡量传感器质量的定量指标。
三、研究结果
- 原理验证 eGFP TLISA：研究人员以检测增强型绿色荧光蛋白（eGFP）为模型，构建了 TLISA 生物传感器。该传感器由三个质粒组成，分别编码融合了抗 eGFP 纳米抗体的 T7RNAP<sub>Nev</sub>、T7RNAP<sub>C</sub>以及受 T7 启动子调控的 LacZ 报告质粒。实验结果表明，加入 eGFP 后，LacZ 的表达速率相对于缓冲液和无关蛋白对照组明显增加，证明了 TLISA 平台检测蛋白质的功能。该传感器能够检测到 100 - 500 nM 的 eGFP，且反应对不同批次的裂解物和不同实验日期的变化具有稳健性。
- TLISA 平台的灵活性：为验证 TLISA 平台的模块化特性，研究人员测试了不同抗 eGFP 纳米抗体组合对传感器性能的影响。结果发现，TLISA 对纳米抗体序列的变化具有较强的耐受性，多种组合在未优化反应条件的情况下即可产生功能性生物传感器。研究还发现，不同类型的蛋白质亲和结构域，如单结构域抗体（MB）和设计锚蛋白重复蛋白（DARPin），均可与 TLISA 平台兼容，且改变连接聚合酶片段与亲和结构域的接头长度以及纳米抗体融合的末端，会对传感器性能产生不同影响。
- TLISA 可轻松重新设计以检测不同抗原：研究人员通过克隆带有抗 mCherry 纳米抗体融合的新质粒，构建了用于检测 mCherry 的 TLISA 传感器。实验测试了 16 种可能的纳米抗体组合，发现多种组合可产生功能性传感器，且该平台可使用除 LacZ 之外的报告蛋白，如超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。此外，TLISA 对不同的 CFE 系统具有稳健性。
- 临床相关生物传感器的快速开发：研究人员利用 TLISA 平台成功构建了用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）刺突（S）蛋白受体结合域（RBD）和转甲状腺素蛋白（TTR）的生物传感器。针对 SARS-CoV-2 RBD 的传感器在 35 - 45 分钟内即可实现检测，虽然其检测限（LOD）目前高于商业化的快速抗原检测，但展示了 TLISA 快速构建临床相关生物传感器的能力。针对 TTR 的传感器可在 1 小时内检测到 TTR，通过优化接头长度和报告质粒浓度，可提高其性能。
- 迈向 POC 应用：TLISA 在复杂生物样本基质（如人血清和唾液）中能够稳健地检测目标蛋白。研究人员在反应体系中添加了 RNase 抑制剂，以应对人血清和唾液中较高的 RNase 活性。实验表明，TLISA 可在室温下检测 SARS-CoV-2 S 蛋白，且具有比色输出，便于无设备条件下的结果解读。此外，TLISA 在冻干后仍能保持功能，这为其在资源有限的环境中的应用提供了可能。
四、研究结论与意义
研究人员开发并表征了一种适应性强、可推广的 CFE 生物传感平台 TLISA，用于蛋白质检测。该平台具有高度的模块化特性，可使用多种亲和结构域检测不同抗原，能与不同的报告蛋白连接，并可在商业和自制的 CFE 配方中实施。TLISA 对实验条件的变化具有稳健性，在室温、复杂生物基质和冻干后均能正常工作，实现了在 1 小时内对人唾液中 SARS-CoV-2 RBD 的室温比色检测。
与现有 POC 检测方法相比，TLISA 在成本和模块化方面具有显著优势，虽然其未优化的检测限目前不如高度工程化和优化的 LFA 和 ELISA，但在新传感器的快速开发和部署方面具有极大潜力，且在易用性和检测时间上具有竞争力。即使在当前未优化的阶段，TLISA 作为一种模块化、可规模化、适用于现场部署的技术，也具有很强的竞争力。
此外，TLISA 在临床实验室中也具有独特的优势。与广泛使用的 ELISA 相比，其工作流程更简单，受操作人员差异的影响更小，检测所需的样本体积极小，这对于新生儿护理等临床场景具有重要意义。
该研究成果发表于Science Advances期刊，为蛋白质检测技术的发展开辟了新的道路，有望在未来的临床诊断和疾病管理中发挥重要作用。随着进一步的优化和研究，TLISA 可能会在全球健康领域产生深远的影响，尤其是在资源有限的地区，为提高疾病检测的可及性和准确性提供有力支持。
