肿瘤细胞中 ATF4 调控 CD58 影响免疫突触形成及肿瘤免疫治疗的新发现

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【字体：大中小】 时间：2025年02月26日 来源：Journal of Translational Medicine 6.1

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　　为探究肿瘤细胞调节共刺激分子的机制，南方医科大学南方医院研究人员开展 ATF4 对 CD8? T 细胞功能影响的研究，发现 ATF4 可削弱 CD58 表达，为肿瘤免疫治疗提供新方向。

　　肿瘤免疫治疗近年来发展迅速，就像一场与肿瘤细胞的激烈 “战斗”。免疫系统中的 CD8? T 细胞（细胞毒性 T 淋巴细胞）堪称 “抗癌战士”，它能精准识别并消灭肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的关键力量。而共刺激分子在这场 “战斗” 中至关重要，它就像给 “抗癌战士” 的强力 “助推器”，能让 CD8? T 细胞充分激活并发挥强大的杀伤能力，同时还参与免疫突触（Immunological Synapse，IS）的形成，这是 CD8? T 细胞与肿瘤细胞连接并传递 “攻击指令” 的特殊结构。

然而，肿瘤细胞十分 “狡猾”，常常想出各种办法来逃避 CD8? T 细胞的攻击。其中一种策略就是抑制共刺激分子的表达，导致免疫突触难以正常形成，让 “抗癌战士” 失去战斗力。在众多共刺激分子中，CD58 是关键成员，它与 CD8? T 细胞表面的 CD2 分子结合，能显著增强 CD8? T 细胞的活性。但肿瘤细胞中 CD58 的表达常常出现异常，不是发生突变就是表达下调，这严重影响了肿瘤免疫治疗的效果。可目前对于肿瘤细胞内部调节 CD58 等共刺激分子的机制，科学家们还知之甚少。

同时，激活转录因子 4（Activating Transcription Factor 4，ATF4）在肿瘤发展过程中也扮演着重要角色。之前研究发现，ATF4 在多种癌症中表达升高，还会营造一个不利于免疫细胞发挥作用的肿瘤微环境，阻碍 CD8? T 细胞的浸润，促进肿瘤生长。但 ATF4 究竟如何影响 CD8? T 细胞的功能，一直是个未解之谜。

为了揭开这些谜团，南方医科大学南方医院的研究人员开展了一系列深入研究。他们的研究成果为肿瘤免疫治疗领域带来了新的曙光，相关论文发表于《Journal of Translational Medicine》。

研究人员采用了多种技术方法。在细胞实验方面，培养多种细胞系，进行转染实验改变基因表达；通过免疫荧光（IF）、蛋白质免疫印迹（Western blot）等技术检测蛋白表达；利用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析基因表达水平；构建细胞共培养体系研究细胞间相互作用；开展细胞毒性实验评估 CD8? T 细胞的杀伤能力。在动物实验方面，建立小鼠肝癌原位移植模型，给予不同处理后观察肿瘤生长情况，并对肿瘤组织进行分析。此外，还对人肝癌组织样本进行免疫组化（IHC）检测，结合多种数据库分析基因相关性等。

研究结果如下：

ATF4 通过直接接触损害 CD8? T 细胞功能：研究人员检测肝癌患者组织发现，肿瘤相关 ATF4 水平与 CD8? T 细胞毒性所需的颗粒酶 B（Granzyme B，GZMB）表达呈负相关。体外将 CD8? T 细胞与肝癌细胞直接共培养，发现肝癌细胞中 ATF4 过表达会降低 CD8? T 细胞中 GZMB 和干扰素 γ（Interferon gamma，IFNG）的表达，沉默 ATF4 则效果相反，且 ATF4 过表达保护肝癌细胞免受 CD8? T 细胞杀伤。进一步实验表明，ATF4 对 CD8? T 细胞毒性的影响依赖细胞间直接接触。同时，研究发现 ATF4 会干扰免疫突触形成，过表达 ATF4 减少了 CD8? T 细胞与肝癌细胞的结合，沉默 ATF4 则增加结合，这表明 ATF4 通过干扰免疫突触形成降低 CD8? T 细胞毒性。
ATF4 介导肿瘤相关 CD58 下调损害 CD8? T 细胞毒性：研究人员基于蛋白质组学数据发现，模拟 ATF4 过表达会使 CD58 蛋白表达显著下调。在肝癌细胞中过表达或沉默 ATF4，通过 Western blot 和流式细胞术证实 ATF4 促进 CD58 下调。构建 CD58 敲低的肿瘤细胞发现，其会削弱 CD8? T 细胞的免疫功能，减少 GZMB 和 IFNG 表达，缩短免疫突触形成时间。同时，实验表明肿瘤相关 CD58 是 ATF4 调节 CD8? T 细胞毒性所必需的，ATF4 通过降低肿瘤相关 CD58 表达减少稳定免疫突触的形成，损害 CD8? T 细胞的细胞毒性活性。
ATF4 通过发动蛋白 1（Dynamin1，DNM1）介导 CD58 降解：研究人员发现 ATF4 调节 CD58 表达时，CD58 的 mRNA 水平不变，提示存在其他调控机制。通过分析 RNA-Seq 数据和基因靶点数据，发现 DNM1 可能是关键调节因子，且 ATF4 与 DNM1 的 mRNA 表达在肝癌组织中呈正相关。进一步实验表明，ATF4 可促进 DNM1 的 mRNA 和蛋白表达，DNM1 是 ATF4 的直接转录靶点。使用 dynasore 抑制 DNM1 活性，可恢复 CD58 表达，逆转 ATF4 对 CD8? T 细胞功能的抑制，表明 DNM1 在 ATF4 介导的 CD58 降解和 CD8? T 细胞功能障碍中起重要作用。
ATF4 驱动 DNM1 依赖的内吞作用（DDE）促进 CD58 降解：由于 DNM1 参与膜表面蛋白内吞，研究人员推测其通过 DDE 促进 CD58 降解。免疫荧光实验显示，过表达 DNM1 或 ATF4 会增加早期内体和晚期内体 / 溶酶体标记物的表达，同时降低 CD58 表达。利用表达 GFP-CD58 和 mCherry-TfR 的肝癌细胞进行时间推移成像，发现过表达 ATF4 或 DNM1 会增加 CD58 与 TfR 的共定位，降低 CD58 荧光水平，表明 CD58 通过 ATF4 驱动的 DDE 被靶向降解。此外，抑制 DDE 对肿瘤细胞增殖影响不显著，但可能通过影响 AKT 通路减轻 CD58 促进的增殖效应。
ATF4 在体内干扰 CD8? T 细胞的抗肿瘤免疫：使用内质网应激激动剂衣霉素（Tunicamycin，TM）和毒胡萝卜素（Thapsigargin，TG）处理小鼠肝癌原位移植模型，模拟 ATF4 过表达，发现会导致肿瘤体积增大，抑制 CD8? T 细胞中 IFNG 和 GZMB 的表达。而构建 ATF4 稳定敲低的肝癌细胞小鼠模型，发现肿瘤体积缩小，CD48（小鼠中与人类 CD58 同源的分子）表达增加，IFNG? CD8? T 细胞和 GZMB? CD8? T 细胞增多，表明肿瘤特异性 ATF4 抑制 CD8? T 细胞功能。
抑制 ATF4 和使用丙氯拉嗪（Prochlorperazine，PCZ）可提高抗 PD1 治疗效果：研究人员推测抑制 ATF4 有利于抗 PD1 治疗，构建小鼠模型实验发现，敲低 ATF4 联合抗 PD1 治疗进一步减小肿瘤体积。PCZ 作为 FDA 批准的 DDE 抑制剂，联合抗 PD1 治疗可显著降低肿瘤负担，增加 CD8? T 细胞数量和 GZMB 表达，增强 CD8? T 细胞免疫监视和抗 PD1 治疗效果。
ATF4 和 CD58 在肿瘤免疫和免疫治疗疗效中的相反作用：通过分析多种数据发现，CD58 表达与效应细胞、细胞毒性淋巴细胞和 T 细胞的浸润水平呈正相关，而 ATF4 呈负相关。在接受免疫治疗的肝癌患者中，CD58 在治疗响应组表达上调，ATF4 表达无差异，但高表达 ATF4 的患者预后更差，表明 CD58 和 ATF4 对免疫治疗疗效的影响相反。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了肿瘤细胞中 ATF4 通过加速 DDE 促进 CD58 降解，阻碍免疫突触稳定形成，抑制 CD8? T 细胞功能的机制。抑制 ATF4 或阻断 DDE 可增强 CD8? T 细胞毒性，提高抗 PD1 免疫治疗效率，为肝癌治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。同时，研究还发现 CD58 在肿瘤免疫和肿瘤增殖中的双重作用，阻断 DDE 有望平衡这两种作用。此外，ATF4 作为潜在治疗靶点存在复杂性，而 PCZ 作为 FDA 批准药物，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路，但其在肿瘤治疗中的应用还需进一步临床试验验证。

总之，这项研究为肿瘤免疫治疗机制提供了新见解，为未来开发更有效的肿瘤治疗方法奠定了基础，有望让肿瘤患者在这场与肿瘤的 “战斗” 中获得更多胜利的机会。

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