《BMC Bioinformatics》：goloco: a web application to create genome scale information from surprisingly small experiments
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为解决 CRISPR 筛选实验可扩展性受限问题，研究人员提出 “CRISPR 损失性压缩” 方法，开发 goloco 工具，降低实验成本与复杂度，推动大规模功能基因组学研究。
一、研究背景
在生命科学的探索中，了解基因的功能一直是核心任务。功能基因组学（Functional genomics）致力于通过各种手段解读基因功能，其中 CRISPR 技术的出现，为研究基因功能带来了新的曙光。利用 CRISPR 技术，科研人员能够有针对性地敲除特定基因，观察细胞发生的变化，进而推断基因的功能。然而，目前基于 CRISPR 技术的实验却面临着一个重大挑战 —— 可扩展性受限。
在全面的 CRISPR 筛选实验中，往往需要使用数百万个细胞和数千个单导向 RNA（sgRNA） ，这使得实验的规模和成本急剧增加。以一个普通的哺乳动物生长调节实验为例，在单一实验条件下，就需要约 80,000 个独特的 sgRNA 和约 8000 万个细胞。如此庞大的资源需求，使得大规模的功能基因组学研究变得异常艰难，许多重要的实验因资源限制而无法开展。
为了突破这一瓶颈，来自相关研究机构的科研人员开展了一项极具创新性的研究，旨在寻找一种新的方法，既能降低 CRISPR 筛选实验的复杂度，又能实现基因组规模的功能研究，“CRISPR 损失性压缩”（CRISPR lossy compression）这一概念应运而生。这项研究成果发表在BMC Bioinformatics期刊上。
二、研究方法
研究人员开发了一种名为 goloco 的交互式网络应用程序。该应用采用了独特的三节点架构：Dash 前端服务器负责接收用户请求，处理交互式可视化和导航；Celery 后端工作器执行推理任务；Redis 键值存储则用于管理前端和后端之间的通信。
在数据方面，goloco 使用了 Broad Institute 进行的全基因组 CRISPR 筛选数据，这些数据可在 Dependency Map（DepMap）门户网站上公开下载。研究人员采用 19Q4 版本的 CRISPR 基因效应数据库，该数据库中的基因效应分数以 CERES（Cell viability and Essentiality Estimation through Regression on sample Specific copy number）分数表示，它通过将所有常见必需基因的平均值定义为 -1，所有常见非必需基因的平均值定义为 0，并对拷贝数变异进行调整，来衡量生长调节的 Log?倍变化。
为了进行基因效应预测，研究人员利用了数千个随机森林模型（Random Forest Models）。在计算预测结果的显著性时，会计算 Z 分数（Z - score）和 P 值（P - value）。此外，研究人员还运用了 Louvain 方法构建基因网络社区，通过 PHATE 降维技术和 k - 均值聚类分析不同细胞系对基因网络的利用表型。
三、研究结果
（一）goloco 应用功能强大
goloco 应用程序允许用户直接使用压缩列表（如 200 个基因的列表）的分数进行全基因组推断。用户还能上传 CRISPR 实验的原始基因计数数据，将其转换为 CHRONOS 分数以校正实验假象。整个分析过程无需用户具备编程知识，任务完成后，结果会在应用程序内呈现，并提供交互式会话，方便用户进行后续分析，且会话可下载保存，以便日后重新加载。
（二）多种可视化分析
该工具提供了多种可视化分析方式。火山图（Volcano plot）可展示预测分数与 P 值的关系，突出显示显著预测结果；通过将预测分数按 Z 分数的极端程度排序，并与该基因在所有其他 DepMap 细胞系中的小提琴图对比，能直观呈现基因特征。在功能富集分析方面，用户可直接在网络应用程序上使用 gProfiler2 对火山图和 Z 分数图中的 “命中” 基因进行分析，获得曼哈顿图（Manhattan plot）和基因本体论（GO）术语的功能富集分数表。
（三）基因关系分析
用户能够对感兴趣的基因进行单基因和多基因成对比较，并进行线性回归分析。在 “Explore> Regressions” 页面，用户选择特定 Louvain 社区内的基因，可可视化网络基因中相关的遗传依赖关系，将用户实验中预测的基因效应成对比较结果与 DepMap 19Q4 数据中所有细胞系测量效应的背景回归进行叠加，从而对比预测相关性。
（四）社区与聚类分析
研究人员利用 Louvain 方法开发了 200 个 Louvain 社区，通过对每个社区进行分析，使用 PHATE 降维后进行 k - 均值聚类，为每个网络确定了七个聚类，每个聚类代表一种网络利用表型。同时，还在其他降维技术（如 PCA、UMAP 和 tSNE）上可视化这些聚类，并使用半监督方法生成每个聚类中基因的重要性排名列表，以确定定义每个聚类的最重要基因。
四、研究结论与讨论
研究人员开发的 “CRISPR 损失性压缩” 方法及 goloco 工具，为大规模功能基因组学研究提供了新的解决方案。该方法通过聚焦关键遗传节点，构建包含 100 - 1000 个基因的压缩集，大大降低了 CRISPR 筛选实验的规模和成本，使之前因资源限制无法开展的全基因组规模研究成为可能。
然而，这种方法也存在一定的局限性。由于压缩集中存在信息损失，可能会遗漏一些微妙的基因功能或特定背景下的基因效应。此外，部分基因在单独敲除时可能确实难以观察到明显效果，这也会影响预测的准确性。但随着数据的不断积累，预测的准确性有望提高。
总体而言，“CRISPR 损失性压缩” 方法具有巨大的潜力。它不仅能够帮助科研人员在低成本下探索基因组功能，还能为研究新型药物靶点、促进合理药物设计等提供有价值的信息，推动生命科学和健康医学领域的进一步发展。
