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为探究 FvMYB46 在草莓花和果实发育中的功能，研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术，发现其调控花粉萌发、果实坐果等，对草莓研究意义重大。
草莓，作为一种深受大众喜爱的水果，不仅口感鲜美，还富含多种营养成分。然而，草莓的产量和品质受到多种因素的影响，其中花粉萌发和果实发育的机制一直是科研人员关注的焦点。在植物的生长发育过程中，许多基因和代谢途径参与其中，调控着各个环节的正常进行。MYB 转录因子家族在植物的生长、发育和应对环境胁迫等方面发挥着重要作用，其中 MYB46 转录因子更是在多个生理过程中扮演关键角色。但在草莓（Fragaria vesca）中，FvMYB46 在花和果实发育过程中的具体作用及机制尚不清楚。为了解开这个谜团，研究人员展开了深入研究。
此次研究由相关科研团队开展，旨在揭示 FvMYB46 在草莓花和果实发育中的功能。研究结果表明，FvMYB46 对草莓的花粉萌发和果实坐果有着重要的调控作用，它通过调节碳水化合物代谢、次生细胞壁生物合成以及黄酮类生物合成等多个途径，影响着草莓的育性和果实早期发育。这一研究成果对于深入理解草莓的生长发育机制，提高草莓的产量和品质具有重要意义。该研究成果发表于《BMC Plant Biology》期刊。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，用于构建 FvMYB46 基因敲除突变体；二是转录组测序（RNA-seq）技术，对突变体和野生型草莓花进行转录组分析，以确定受 FvMYB46 调控的基因和代谢途径；三是高效液相色谱（HPLC）技术，用于分析草莓花中酚类化合物的含量变化。
研究结果
- FvMYB46 的表达分析：研究人员通过 BLASTn 搜索，确定了 FvH4_3g28890 为 FvMYB46。qRT-PCR 分析显示，FvMYB46 在根、幼叶和成熟浆果中表达较低，在成熟叶和幼苗中表达稍高，在开放花、花序茎和幼浆果中表达较高。eFP 浏览器分析表明，FvMYB46 在受精前花发育第 11 阶段的花药和受精后早期果实发育的子房壁中表达最高。
- CRISPR-Cas9 敲除 FvMYB46：为研究 FvMYB46 的功能，研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术，以草莓内源 FvU6-1 启动子驱动 gRNA 表达，构建了 FvMYB46 基因敲除载体。通过 PCR 筛选和测序，获得了三种不同基因型的突变体，包括 81bp 缺失（FvMYB46-81）、82bp 缺失（FvMYB46-82）和双等位基因 81/82bp 缺失（FvMYB46-81/82）。81bp 缺失导致 27 个氨基酸的框内缺失，82bp 缺失导致移码突变，产生无功能的蛋白。经检测，该 gRNA 敲除具有较高的特异性，无脱靶突变。
- FvMYB46 突变体的果实坐果分析：通过计算果实坐果率，研究发现 FvMYB46-82 和 FvMYB46-81/82 突变体的果实坐果率显著低于野生型。许多突变体花在早期花托果实发育阶段停滞，随后死亡干枯。同时，突变体中花粉萌发的花朵数量减少，表明 FvMYB46 参与花粉发育和 / 或花粉活力的调控。在营养生长阶段，除果实产量降低和早期果实发育停滞频率增加外，突变体植株无其他明显形态异常。
- 花序和花药次生细胞壁的显微镜分析：对 FvMYB46-82、FvMYB46-81/82 和野生型花药进行间苯三酚 - HCl 染色，发现突变体花药染色程度较野生型有所降低，尤其是面对花丝结缔组织和维管束的内皮细胞，但野生型和突变体花的总木质素含量无显著差异，说明 FvMYB46 正向调控这些组织中次生细胞壁的木质化。
- FvMYB46-81/82 和 FvMYB46-82 花的转录谱分析：对开放花进行 RNA-seq 分析，发现 FvMYB46-82 和 FvMYB46-81/82 突变体中分别有 631 个和 1247 个基因下调，544 个和 925 个基因上调。主成分分析（PCA）显示，突变体与野生型的基因表达存在差异。
- 差异表达基因（DEGs）的功能富集分析：GO 富集分析表明，FvMYB46-82 花中下调的 DEGs 在次生代谢产物、细胞壁、木质素生物合成和代谢以及苯丙烷生物合成和代谢等相关术语中富集；FvMYB46-81/82 花中下调的 DEGs 除上述富集术语外，还在 “光合作用”“木聚糖生物合成” 和 “木聚糖代谢过程” 等术语中富集。在分子功能类别中，两个突变体花中下调的 DEGs 均在 “氧化还原酶活性” 相关术语中富集；在细胞组成类别中，均在 “质外体” 和 “细胞外区域” 中富集。进一步的功能分类和代谢途径分析证实，突变体花中参与细胞壁组织、木质素和单木质素结合与聚合的基因显著下调，参与次生代谢产物代谢、氧化还原稳态的基因富集，果胶和其他细胞壁基因上调。
- 酚类化合物分析：HPLC 分析鉴定出 18 种酚类化合物，包括黄酮醇、黄烷 - 3 - 醇以及鞣花酸和羟基肉桂酸的衍生物。突变体中黄烷 - 3 - 醇和黄酮醇含量低于野生型，其中 FvMYB46-81/82 突变体中含量最低。个别化合物中，表儿茶素、原花青素 3、槲皮素葡萄糖苷和山奈酚 - 3 - 香豆酰己糖苷的下调最为显著。
研究结论与讨论
综上所述，研究人员通过对 CRISPR-Cas9 介导的 FvMYB46 基因敲除突变体的功能分析，揭示了 FvMYB46 在草莓花粉萌发和果实坐果过程中的重要调控作用。转录组分析表明，FvMYB46 正向调控参与次生细胞壁形成、花粉管生长、活性氧清除以及苯丙烷途径（包括木质素和黄酮类生物合成）的基因。代谢物分析进一步证实了 FvMYB46 在黄酮类生物合成中的作用，突变体花中黄酮醇和黄烷 - 3 - 醇含量降低。此外，FvMYB46 突变体中与碳水化合物代谢和糖信号相关的基因表达发生变化，表明 FvMYB46 在调控碳水化合物代谢与苯丙烷生物合成之间的相互作用中发挥重要作用。
该研究不仅为深入理解草莓的生殖发育机制提供了新的见解，还为通过基因工程手段改良草莓品种，提高草莓产量和品质奠定了理论基础。同时，研究中发现的 FvMYB46 调控网络和相关代谢途径，也为其他植物的生长发育研究提供了参考，有助于推动植物科学领域的进一步发展。
