解析 CIB2-TMC1 互作机制：解锁听觉奥秘与耳聋治疗新希望
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时间：2025年02月26日
来源：Communications Biology 5.2
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为探究 TMC1 与 CIB2/CIB3 的分子互作机制，研究人员开展相关研究，解析了 CIB2-TMC1 复合体结构，揭示 Ca2?调节作用，为耳聋治疗提供新思路。
在人类的听觉世界里，声音的感知宛如一场精妙的 “分子交响乐”。哺乳动物的听觉起始于耳蜗毛细胞（cochlear hair cells）中的机械电转导（mechanoelectrical transduction，MET）过程。想象一下，耳蜗毛细胞就像一个个精密的传感器，镶嵌在柯蒂氏器（organ of Corti）内，其顶端的静纤毛如同排列整齐的阶梯。而位于静纤毛顶端的特殊通道，堪称这场 “交响乐” 的关键演奏者，它们负责将外界的机械刺激转化为电信号，让我们得以感知丰富多彩的声音世界。
在这个复杂的过程中，TMC1 和 TMC2 这两种跨膜蛋白，作为 MET 通道的主要组成部分，起着举足轻重的作用。它们不仅具备形成离子通道孔的能力，对 Ca2?具有较高的通透性，而且其特定突变与遗传性耳聋紧密相关。然而，TMC1 和 TMC2 并非独自 “表演”，辅助亚基在调节 MET 通道功能方面同样不可或缺。其中，钙和整合素结合蛋白 2（Calcium- and integrin-binding protein 2，CIB2）尤为关键。
CIB2 主要在耳蜗毛细胞中表达，能与 TMC1/TMC2 的 N 端胞质区域相互作用。它就像一个 “分子胶水”，不仅参与调节 TMC1 在静纤毛内的运输和定位，其突变还会导致静纤毛出现显著的形态缺陷，进而引发非综合征性耳聋。尽管此前对 CIB2 和 TMC1 的研究已有不少，但哺乳动物中 CIB2 与 TMC1 相互作用的结构和机制细节仍如同迷雾，亟待揭开。
为了驱散这层迷雾，深入了解 MET 过程及其在听觉功能和障碍中的作用，研究人员踏上了探索之旅。此次研究成果发表于《Communications Biology》期刊。
研究人员运用了多种技术手段来开展此项研究。结构解析方面，采用 X 射线晶体学（X-ray crystallography）技术解析哺乳动物 CIB2-TMC1 复合体的高分辨率结构；蛋白相互作用分析上，借助等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）、分析型凝胶过滤色谱（analytical gel filtration chromatography，AGFC）等技术，精准测定蛋白间的结合亲和力及结合比例。此外，还利用定点突变（site-directed mutagenesis）技术探究关键氨基酸残基在蛋白相互作用中的作用。
研究人员首先对 CIB2-TMC1 的相互作用进行了细致的表征。通过 ITC 实验发现，人 TMC1 的 86 - 136 氨基酸片段（CBD - 1）是与全长人 CIB2 结合的关键区域，且二者以 1:1 的比例结合形成稳定的复合物。进一步研究表明，TMC1 与 CIB2、CIB3 的结合较强，与 CIB1 的结合较弱，与 CIB4 则无明显结合。
为了深入探究 CIB2-TMC1 复合体的组装机制，研究人员成功解析了该复合体的晶体结构。结构显示，CIB2 呈现出具有四个 EF - hand 结构域的超螺旋折叠，其中只有第三和第四个 EF - hand 结构域对阳离子有响应。在纯化和结晶条件下，观察到镁离子（Mg2?）结合在 EF3 和 EF4 上。CIB2 与 TMC1 的结合界面包含 α1 - 螺旋、α5 - 螺旋以及连接 α1 和 α2 螺旋的环，TMC1 通过两个 α - 螺旋与 CIB2 相互作用。
在 CIB2-TMC1?CBD - 1?界面的详细结构特征研究中，静电势分析揭示 CIB2 表面存在一个带负电的中央口袋，是其与 TMC1 的结合位点。结构研究表明，CIB2-TMC1?CBD - 1?界面主要通过静电相互作用、氢键以及疏水相互作用来稳定。定点突变实验验证了这些关键残基在结合中的重要性，突变关键残基会削弱或消除 CIB2 与 TMC1?CBD - 1?的结合。
序列和结构分析发现，CIB 家族蛋白在物种间具有高度的结构保守性。人 CIB2 - TMC1?CBD - 1?复合体中的关键界面残基在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的 CALM - 1 - TMC - 1 复合体中同样存在。而且，CIB2 与 CIB3 的结构相似性极高，TMC1 上的两个 CIB2 结合位点（CBD - 1 和 CBD - 2）是不同且不重叠的。Co - IP 实验进一步证实，TMC1 的 CBD - 1 和 CBD - 2 对于其与 CIB2 在生理条件下的完整相互作用至关重要。
鉴于 CIB2 能结合 Ca2?并发生构象变化，研究人员深入研究了 Ca2?对 CIB2 - TMC1 相互作用的调节作用。ITC 实验表明，随着 Ca2?浓度的增加，CIB2 与 TMC1?CBD - 1?的相互作用逐渐增强，在 1mM Ca2?时达到饱和。与 CIB2 - TMC1?CBD - 1?相互作用不同，CIB2 与 TMC1?CBD - 2?的结合完全依赖于 Ca2?，在无 Ca2?条件下二者不结合，随着 Ca2?浓度升高，结合逐渐增强。实验还证实，Ca2?结合的 CIB2 能够同时与 TMC1?CBD - 1?和 TMC1?CBD - 2?相互作用形成三元复合物。
研究人员还探究了与耳聋相关的 CIB2 突变对其与 TMC1?CBD - 1?和 TMC1?CBD - 2?结合的影响。对七个与听力损失相关的 CIB2 突变进行研究发现，这些突变虽不在已确定的结合界面上，但却显著影响了 CIB2 与 TMC1 两个结合位点的结合。例如，F91S 突变几乎完全消除了 CIB2 与 TMC1?CBD - 1?的结合，而 I123T 突变则主要影响了 CIB2 与 TMC1?CBD - 2?的结合。
在本研究中，研究人员成功解析了 CIB2 - TMC1?CBD - 1?复合体的结构，确定了关键的界面残基，揭示了 Ca2?在调节 CIB2 与 TMC1 相互作用中的重要作用。这些发现不仅加深了对 MET 通道复合物组装和功能调节机制的理解，也为深入探究听觉感知和耳聋发生的分子机制提供了重要线索。研究还发现，某些与耳聋相关的 CIB2 突变会破坏其与 TMC1 的结合，这为开发针对 CIB2 相关耳聋的治疗策略提供了潜在的靶点和方向。然而，目前对于 Ca2?对 MET 通道的影响仍有许多未知之处，未来还需要更多的研究来进一步揭示 CIB2 在机械电转导过程中的具体作用。
此项研究运用的关键技术方法包括：X 射线晶体学技术用于解析 CIB2 - TMC1 复合体结构；等温滴定量热法和分析型凝胶过滤色谱技术分析蛋白结合特性；定点突变技术探究关键残基作用。
