揭秘盐沼盐杆菌 N - 糖基化途径中硫酸转移酶的关键作用

本文通过多种研究方法揭示盐沼盐杆菌（Halobacterium salinarum）N - 糖基化途径中 VNG1056C 和 VNG1057C 的功能及意义。

　　

盐沼盐杆菌 N - 糖基化研究背景

盐沼盐杆菌（Halobacterium salinarum）是一种嗜盐古菌，能在接近或达到饱和的 NaCl 浓度环境中生长。它在生物学上有诸多新奇之处，例如是首个被发现具有非真核生物蛋白糖基化现象的生物，其表面（S）层糖蛋白和古菌鞭毛蛋白（archaellins）都存在 N - 糖基化修饰。

盐沼盐杆菌 N - 糖基化修饰的 N - 连接四糖结构为 α-D-GlcA (2S)-(1→4)-α-L-IdoA (3S)-(1→4)-α-D-GlcA-(1→4)-α-D-Glc-Asn，其中 Glc 代表葡萄糖，IdoA 代表艾杜糖醛酸，GlcA 代表葡萄糖醛酸，S 表示硫酸化修饰。此前研究已确定了部分参与 N - 糖基化途径的酶，如 Agl28、Agl25、Agl26、Agl27 作为糖基转移酶负责依次添加四糖的四个糖残基，Agl29 是翻转酶，AglB 是寡糖基转移酶。然而，该途径中负责修饰四糖中第三和第四个糖残基（IdoA 和 GlcA）的硫酸转移酶仍未被确定。

研究目的与方法

本研究旨在确定盐沼盐杆菌 N - 糖基化途径中负责修饰四糖的硫酸转移酶，并探究糖基硫酸化的顺序、这些修饰对细胞功能的影响以及相关基因的转录调控机制。研究采用了生物信息学、遗传学、生物化学、结构生物学和细胞生物学等多种方法。

在生物信息学方面，通过 BLAST 搜索、InterPro 分析和结构同源性分析，预测 VNG1056C、VNG1057C 和 VNG1063H 这三个基因编码的蛋白可能与硫酸化过程相关。

遗传学方法上，利用双交换反向选择法构建了缺失 VNG1056C、VNG1057C、VNG1063H 或同时缺失 VNG1056C 和 VNG1057C 的突变菌株，并通过 PCR 和 qRT-PCR 对突变菌株进行验证。

生物化学方法中，运用液相色谱 - 电喷雾电离质谱（LC-ESI MS）分析各菌株中 N - 连接四糖的硫酸化程度；通过平板运动实验和透射电子显微镜（TEM）观察突变菌株的细胞运动和古菌鞭毛丝的组装情况。

结构生物学方法则借助 AlphaFold 预测蛋白结构，并使用 DALI 服务器进行结构同源性分析。细胞生物学方法用于研究蛋白的亚细胞定位，通过将带有标签的蛋白在Hfx. volcanii中表达，然后进行亚细胞分级分离和免疫印迹实验。

研究结果

1. 生物信息学预测结果：BLAST 搜索和 InterPro 分析显示，VNG1056C、VNG1057C 和 VNG1063H 可能是硫酸处理蛋白。结构同源性分析表明，VNG1056C 和 VNG1063H 与Bacteroides thetaiotaomicron的 2-O 糖胺聚糖硫酸酯酶 BT1596 结构相似，VNG1057C 与Formosa agariphila的家族 S1_7 ulvan 特异性硫酸酯酶 FA22070 结构相似。
2. 基因缺失对 N - 连接四糖硫酸化的影响：LC-ESI MS 分析发现，缺失 VNG1056C 或 VNG1057C 会显著降低 N - 连接四糖的硫酸化程度，但不会完全消除。同时，通过分析特定肽段的质谱峰，推测 VNG1056C 负责硫酸化四糖中第三位的 IdoA，VNG1057C 负责硫酸化末端的 GlcA，且二者的修饰作用相互独立。
3. 硫酸化修饰对细胞运动的影响：平板运动实验表明，缺失 VNG1056C 会使细胞运动能力略有下降，但远小于缺失参与四糖组装的糖基转移酶的影响；缺失 VNG1057C 对细胞运动能力无显著影响。TEM 观察发现，缺失 VNG1056C 或 VNG1057C 不会导致古菌鞭毛丝的聚集，说明轻微的细胞运动变化并非由鞭毛丝聚集引起。
4. 基因缺失对转录的影响：qPCR 结果显示，在正常生长条件下（4.2 M NaCl），缺失 VNG1056C、VNG1057C 或 VNG1063H 不会导致其他两个基因转录水平的显著变化。然而，在低盐浓度（2.9 M NaCl）下，缺失 VNG1056C 会使 VNG1057C 和 VNG1063H 的转录水平显著升高；缺失 VNG1057C 会使 VNG1063H 转录水平升高；缺失 VNG1063H 会使 VNG1057C 转录水平升高。但这种转录水平的升高并未补偿缺失硫酸转移酶导致的糖基硫酸化水平的变化。
5. 蛋白的亚细胞定位：预测算法和实验结果表明，VNG1056C 是膜蛋白，VNG1057C 是胞质蛋白。在Hfx. volcanii中表达带有标签的 VNG1056C 和 VNG1057C，经亚细胞分级分离和免疫印迹实验验证了这一定位结果。
6. 在Hfx. volcanii中的功能验证：在Hfx. volcanii中表达 VNG1056C 或 VNG1057C，LC-ESI MS 分析发现其 S 层糖蛋白的 N - 连接五糖出现了硫酸化修饰，进一步证实了 VNG1056C 和 VNG1057C 是硫酸转移酶。

研究结论

本研究成功鉴定了盐沼盐杆菌 N - 糖基化途径中负责修饰四糖的硫酸转移酶 VNG1056C 和 VNG1057C，并将其重新命名为 Agl30 和 Agl31。明确了它们分别作用于四糖中第三位的 IdoA 和末端的 GlcA，且修饰顺序为先由 Agl30 修饰 IdoA，再由 Agl31 修饰 GlcA。

研究还发现，虽然糖基硫酸化在一定程度上影响细胞运动，但这种影响较小，且糖基硫酸化对古菌鞭毛丝的组装没有明显作用。此外，盐沼盐杆菌在低盐浓度下会调节相关基因的转录水平，但这种调节并不能有效补偿缺失硫酸转移酶导致的糖基硫酸化水平的变化。

这些发现为深入理解盐沼盐杆菌的 N - 糖基化途径提供了重要信息，也为进一步研究古菌的蛋白质糖基化修饰机制奠定了基础。同时，研究中未明确 VNG1063H 的作用靶点，以及糖基硫酸化在其他生长条件下的功能，这些都为后续研究留下了探索空间。