丙酮酸激酶新发现：改写 GTP 合成认知，重塑细胞能量代谢版图

本文揭示丙酮酸激酶（PK）在枯草芽孢杆菌中主要生成 GTP，挑战传统认知，为细胞能量代谢研究提供新思路。

　　

在生命科学的微观世界里，细胞的能量代谢过程犹如一部精密运转的 “分子机器”，每一个环节都至关重要。其中，嘌呤核苷酸三磷酸鸟苷（GTP）和三磷酸腺苷（ATP）作为细胞生理活动的关键 “能量货币”，参与了从核酸合成到信号传导等众多核心过程。一直以来，ATP 被视为细胞通用的能量载体，而 GTP 则在诸如蛋白质合成等特定过程中发挥关键作用。它们的合成途径复杂且精细，从从头合成路径的中间产物次黄嘌呤单核苷酸（IMP）出发，分别经由不同支路生成二磷酸腺苷（ADP）、二磷酸鸟苷（GDP），进而通过底物水平磷酸化和氧化磷酸化等方式转化为 ATP 和 GTP，同时还存在补救合成途径来回收利用环境中的嘌呤核苷和碱基。

在细菌领域，GTP 合成受到严格调控，警报素（p）ppGpp 在其中扮演着 “调控大师” 的角色。当细菌遭遇营养压力时，（p）ppGpp 会大量积累，如同给 GTP 合成按下 “减速键”，通过抑制嘌呤生物合成基因的转录以及关键合成酶的活性，维持细胞内核苷酸的平衡状态。在革兰氏阳性菌中，（p）ppGpp 更是根据营养和环境信号，精准调节 GTP 水平，影响着细菌的生长、核糖体生物发生和翻译过程。一旦（p）ppGpp 缺失，细菌就会陷入 “困境”，对外源鸟苷变得异常敏感，细胞活力急剧下降，这凸显了（p）ppGpp 在维持细菌生存和 GTP 稳态中的关键地位。

在这样的研究背景下，科研人员展开了一项意义非凡的探索。他们以枯草芽孢杆菌为研究对象，聚焦于鸟苷毒性机制。在实验中，缺乏（p）ppGpp 的枯草芽孢杆菌在遇到外源鸟苷时，就像失去了 “导航” 的船只，细胞内鸟嘌呤核苷酸池会异常扩张，导致细胞死亡。为了揭开这一现象背后的秘密，科研人员进行了一场 “基因大筛查”，通过遗传选择的方法，寻找能够抑制鸟苷毒性的自发突变。

令人惊喜的是，他们发现了一些关键的 “线索”—— 多个突变位点与鸟苷毒性抑制相关，其中包括编码鸟苷酸激酶（Gmk）的gmk基因、编码次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HprT）的hprT基因，以及编码丙酮酸激酶（PK）的pyk基因。深入研究后发现，hprT和gmk基因的失活突变，就像是给鸟苷转化为鸟嘌呤核苷酸的 “生产线” 设置了障碍，从而降低了细胞内鸟嘌呤核苷酸的积累，减轻了鸟苷的毒性。

而pyk基因的发现则更加令人瞩目。丙酮酸激酶作为糖酵解途径中的关键酶，一直以来被认为主要通过底物水平磷酸化生成 ATP，为细胞供能，同时推动三羧酸循环（TCA 循环），在细胞能量代谢中占据重要地位。但此次研究中，科研人员发现，在缺乏（p）ppGpp 的细胞中，丙酮酸激酶的失活突变竟然能够有效抑制鸟苷毒性。这一发现引发了科研人员的深入思考：丙酮酸激酶是否隐藏着不为人知的 “秘密功能”？

为了验证这一猜测，科研人员进行了一系列巧妙设计的实验。首先，他们对携带pyk基因突变的菌株进行了细致分析。这些突变菌株在面对鸟苷时，生长状况得到了明显改善，细胞内 GTP 水平也有所降低。通过体外实验，科研人员进一步证实了丙酮酸激酶突变体的功能变化。以 G318E 突变体为例，它在体外几乎丧失了将磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸的能力，同时细胞内 PEP 大量积累，丙酮酸含量显著减少，这表明该突变确实导致了丙酮酸激酶功能的丧失。而且，当在培养基中去除葡萄糖，改用苹果酸作为碳源时，pyk突变体对鸟苷毒性的抑制作用消失，这暗示丙酮酸激酶的这一功能与糖酵解过程密切相关。

那么，丙酮酸激酶失活是如何抑制鸟苷毒性的呢？科研人员最初猜测可能与碳代谢的改变有关。他们对野生型、（p）ppGpp⁰和（p）ppGpp⁰ pyk^G318E菌株进行了代谢组学分析，重点关注中心碳代谢途径中的关键代谢物。结果发现，虽然pyk突变体中丙酮酸和 TCA 循环中间产物水平有所降低，但这些代谢物在（p）ppGpp⁰细胞中的积累并非鸟苷毒性的原因，补充葡萄糖和丙酮酸也无法恢复pyk突变体的鸟苷毒性，这表明鸟苷毒性的抑制并非源于碳代谢的改变。

接着，科研人员将目光转向了核苷酸合成。他们发现，在鸟苷处理后，（p）ppGpp⁰细胞中 GTP 大量积累，ATP 水平下降，而pyk突变体则呈现出不同的景象：GTP 和 UTP 水平显著降低，GDP 水平升高。这一现象暗示丙酮酸激酶可能在鸟苷处理过程中参与了 GDP 到 GTP 的转化，其失活能够阻断这一过程，从而减轻鸟苷毒性。

为了进一步探究丙酮酸激酶与 GTP 合成的关系，科研人员在体外对丙酮酸激酶的核苷酸特异性进行了研究。实验结果令人震惊：当添加不同的核苷二磷酸（NDP）作为底物时，在激活剂一磷酸腺苷（AMP）存在的情况下，丙酮酸激酶对 GDP 的催化效率比 ADP 高 10 倍，对 UDP 的催化效率比 ADP 高 3 倍。这表明在枯草芽孢杆菌中，丙酮酸激酶对 GDP 具有高度的选择性，能够高效地将其转化为 GTP。而且，这一现象并非枯草芽孢杆菌所特有，在粪肠球菌和单核细胞增生李斯特菌中，丙酮酸激酶同样表现出对 GDP 的偏好，这意味着在相关的革兰氏阳性菌中，GTP 可能都可以通过丙酮酸激酶在糖酵解过程中高效合成。

在野生型枯草芽孢杆菌中，丙酮酸激酶是否也主要生成 GTP 呢？科研人员通过模拟生理条件下的体外酶促反应发现，即使在 ADP 浓度高于 GDP 的情况下，丙酮酸激酶仍然优先产生 GTP。这一结果有力地证明，在正常生长条件下，GTP 才是丙酮酸激酶的主要产物，而非传统认知中的 ATP。

为了深入了解丙酮酸激酶在核苷酸合成中的生理作用，科研人员构建了丙酮酸激酶缺失突变体（Δpyk）和核苷二磷酸激酶缺失突变体（Δndk），并对它们的生长情况进行了研究。结果显示，Δpyk突变体在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长严重受阻，补充丙酮酸只能部分缓解这一问题，这表明丙酮酸激酶不仅在碳代谢中发挥作用，还对核苷酸合成至关重要。而 ΔndkΔpyk双突变体在葡萄糖培养基上几乎无法生长，但在苹果酸或葡萄糖与苹果酸混合培养基上生长良好。这一现象揭示了丙酮酸激酶和核苷二磷酸激酶在糖酵解过程中是核苷酸三磷酸（NTP）合成的主要贡献者，二者相互补充，共同维持细胞的正常生长。

综合以上研究结果，科研人员得出了一系列重要结论。丙酮酸激酶在枯草芽孢杆菌及相关革兰氏阳性菌中，具有高效合成 GTP 的能力，且在正常细胞生长过程中，GTP 是其主要产物，这一发现打破了传统观念中丙酮酸激酶主要生成 ATP 的认知。同时，丙酮酸激酶和核苷二磷酸激酶在糖酵解过程中对 NTP 合成起着关键作用，二者缺一不可。这些发现为细胞能量代谢领域开辟了新的研究方向，让我们对细胞内核苷酸合成机制有了更深入的理解。

然而，科研的道路永无止境。虽然此次研究取得了重大突破，但仍有许多谜团等待解开。例如，“死亡 - 由 - GTP”（death-by-GTP）的确切机制尚不清楚，尽管观察到 GTP 积累与细胞死亡相关，但具体是哪些下游事件导致了细胞死亡还不得而知。此外，不同物种中丙酮酸激酶对各种 NTP 的选择性差异及其进化意义也有待进一步研究。未来，科研人员将继续深入探索这些问题，有望为生命科学领域带来更多令人惊喜的发现，为相关疾病的治疗和药物研发提供全新的理论基础。