低剂量白细胞介素 2 疗法：风湿性心脏病治疗新希望

本文研究利用大鼠自身免疫性心瓣膜炎（RAV）模型，探究低剂量白细胞介素 2（LD-IL-2）疗法对急性风湿热（ARF）/ 风湿性心脏病（RHD）的治疗潜力。结果显示，LD-IL-2 能改善心脏功能、减轻炎症、降低抗体反应，有望成为 ARF 的有效免疫治疗药物。

　　### 一、研究背景
风湿性心脏病（RHD）是一种因贫困而被忽视的疾病，在全球范围内影响着约 4000 万人，每年导致超过 35 万人死亡。低收入和中等收入国家以及发达国家的原住民受其影响尤为严重。在澳大利亚，原住民的 RHD 发病率极高。RHD 在心血管疾病致死原因中占近 2%，是儿童后天性心脏病的常见病因。

急性风湿热（ARF）是由 A 组链球菌（GAS，Strep A）感染引发的自身免疫性疾病，约 60% 经历过至少一次 ARF 发作的患者会发展为 RHD，导致心脏瓣膜不可逆损伤。此外，高达 30% 的 ARF 患者会患上 Sydenham 舞蹈病，这是一种以不自主舞蹈样运动和神经精神障碍为特征的神经行为疾病，通常与心脏症状同时出现。在 2016 - 2020 年澳大利亚确诊的 ARF 病例中，近一半是 5 - 14 岁的儿童，且 15 岁以下男性的 ARF 发病率普遍较高，成年女性发病率较高。

RHD 的发病机制与分子模拟有关，针对链球菌蛋白（如 M 蛋白）的抗体和 T 细胞会与宿主心脏蛋白发生反应，导致瓣膜损伤。研究发现，T 辅助细胞（Th1 和 Th17）是 RHD 的关键介质，且 RHD 患者存在调节性 T 细胞（Tregs）缺乏的情况，Th17/Treg 比值升高，这种失衡在多瓣膜受累患者中更为明显。

目前，尚无针对 ARF 进展为 RHD 的特效治疗方法，也没有预防 Strep A 重复感染的疫苗。长期以来，ARF 患者依靠每月注射青霉素预防感染，但患者依从性较差。低剂量白细胞介素 2（LD-IL-2）疗法在治疗一些自身免疫性疾病（如 1 型糖尿病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、类风湿关节炎和丙型肝炎病毒相关血管炎）方面显示出安全性和有效性。该疗法通过特异性靶向 Tregs 促进免疫耐受，同时保留效应免疫细胞功能。本研究利用大鼠自身免疫性心瓣膜炎（RAV）模型，探究 LD-IL-2 疗法能否用于治疗活动性 ARF 并预防其并发症。

二、研究方法

1. 实验动物：选用 4 - 6 周龄的雌性 Lewis 大鼠，实验前在动物中心适应 5 天，所有实验方案均获得动物伦理委员会批准。
2. 重组 M 蛋白制备：将 Strep A emm5 克隆到 pREP4 载体中，在大肠杆菌 BL21 中表达，利用 Ni-NTA 树脂纯化重组 M5 蛋白（rM5），并去除脂多糖（LPS）污染。
3. 诱导自身免疫性心内膜炎和瓣膜炎：大鼠在异氟烷麻醉下，注射乳化于完全弗氏佐剂（CFA）的 rM5 蛋白或 PBS，注射前进行基线心电图（ECG）检测。在第 1 天和第 3 天，大鼠腹腔注射百日咳杆菌毒素，随后在第 7、14 和 21 天，于侧腹注射含相应抗原的不完全弗氏佐剂（IFA）进行加强免疫。第 35 天，大鼠过量注射戊巴比妥钠安乐死，采集血液和心脏组织用于后续分析。
4. LD-IL-2 治疗：将年龄匹配的雌性 Lewis 大鼠分为四组：PBS 组、Strep A rM5 组、Strep A rM5 + IL-2（第 8 天开始治疗）组和 Strep A rM5 + IL-2（第 21 天开始治疗）组。重组人 IL-2 经稀释后，分别从第 8 天或第 21 天开始，每隔一天对相应组大鼠进行皮下注射，持续至第 24 天或第 34 天。
5. 心电图检测：在注射前和安乐死前一天，对所有大鼠进行 1 - 2 分钟的 ECG 检测，分析 P 和 R 点峰值，评估心脏传导异常。
6. 心脏组织病理分析：对福尔马林固定、石蜡包埋的心脏组织进行切片和苏木精 - 伊红（H&E）染色，根据心肌和二尖瓣中单核细胞浸润和局灶性病变数量，用 “心脏炎评分” 评估炎症程度。
7. 组织反应性血清抗体检测：采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA），检测血清中针对心脏肌球蛋白、原肌球蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、多巴胺受体 1 和 2、溶神经节苷脂 GM1 和微管蛋白的 IgG 抗体水平。
8. 多参数流式细胞术分析循环 Tregs：分离纵隔淋巴结制备单细胞悬液，裂解红细胞后，进行表面染色和核内染色，用 BD Fortessa 多参数流式细胞仪检测细胞群体，并用 FlowJo V.10.7 软件分析数据。
9. 统计分析：使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行描述性统计，采用单因素方差分析（ANOVA）和 Dunnett 事后检验进行多重比较，用双因素 ANOVA 评估 ECG 差异，P < 0.05 或 P < 0.01 为差异有统计学意义。

三、研究结果

1. LD-IL-2 疗法预防 RHD 相关的心脏功能和组织学变化：在 RAV 模型中，rM5 注射导致大鼠心脏 P - R 间期延长，表明存在传导异常；而接受 LD-IL-2 治疗的大鼠，P - R 间期无显著变化。H&E 染色显示，rM5 注射组大鼠心肌和瓣膜单核细胞浸润增加，心脏炎评分升高；LD-IL-2 治疗组大鼠单核细胞浸润明显减少，心脏炎评分显著降低，且第 8 天和第 21 天开始治疗的两组之间绝对差异较小。
2. LD-IL-2 疗法降低交叉反应性 M 蛋白抗体水平：ELISA 检测结果显示，rM5 注射组大鼠血清与心脏、结缔组织和神经元组织蛋白的交叉反应性显著高于 PBS 对照组；而 LD-IL-2 治疗组大鼠血清与原肌球蛋白、心脏肌球蛋白的反应性消失，与结缔组织和神经元蛋白的 IgG 抗体水平也显著降低，第 21 天开始治疗组的抗体水平与阴性对照组相似。
3. LD-IL-2 疗法选择性扩增心脏引流淋巴结中的 Tregs：流式细胞术分析表明，LD-IL-2 疗法使注射 rM5 大鼠的经典 Tregs（CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺）增加了 50%。从第 21 天开始接受 LD-IL-2 治疗的大鼠，罕见的 CD8⁺Tregs（CD8⁺CD25⁺FoxP3⁺）数量增加，但第 8 天开始治疗组未出现此现象。此外，LD-IL-2 疗法未改变常规 T 细胞频率，表明其能特异性扩增 Tregs。

四、研究讨论

1. LD-IL-2 疗法对心脏炎症和疾病进程的影响：在先前研究中，多次注射 rM5 会导致大鼠心脏炎症加重和传导异常。本研究中，LD-IL-2 疗法有效逆转了 rM5 诱导的心脏炎症，预防了心脏传导异常的发生。早期或晚期开始 LD-IL-2 治疗均能有效治疗已存在的疾病，但治疗时机可能因自身免疫过程的阶段和慢性程度而影响其疗效。
2. LD-IL-2 疗法对抗体产生的调节作用：在 RHD 和 Sydenham 舞蹈病中，组织交叉反应性抗体在疾病发生中起重要作用。LD-IL-2 可通过促进 Tregs 介导的调节环境，间接影响 B 细胞分化和抗体产生，减少自身反应性抗体的生成。此外，它还能抑制 T 滤泡辅助细胞的活化和分化，限制过度的生发中心反应，促进免疫耐受。
3. 遗传因素与疾病易感性及 LD-IL-2 疗法的应用：虽然人类 ARF/RHD 的遗传因素尚不清楚，但 Lewis 大鼠因特定宿主因素具有自身免疫疾病易感性，其大多数自身免疫相关的 CD4⁺T 细胞反应受 MHC II 类 RT1.BL 限制。因此，本研究在该模型中探究 LD-IL-2 疗法的效果具有重要意义。
4. CD8⁺Tregs 在自身免疫疾病中的作用及 LD-IL-2 疗法的影响：CD8⁺Tregs 在自身免疫疾病发病机制中的作用尚不完全清楚，但它们在免疫调节中发挥重要作用。LD-IL-2 疗法可诱导 CD8⁺Tregs 的产生，尽管其 FoxP3 表达稳定性不如经典 Tregs，但在免疫调节中仍具有重要意义。
5. LD-IL-2 疗法的优势、挑战及前景：LD-IL-2 疗法通过皮下注射能有效减轻链球菌感染后的自身免疫并发症，改善心脏功能，减少炎症和抗体反应。与每月注射青霉素预防 RHD 相比，LD-IL-2 治疗可提供长期的重组 IL-2 供患者在家自行注射，提高了治疗的可及性。然而，IL-2 具有促进免疫耐受和激活的双重作用，使其治疗效果难以预测，且在不同自身免疫疾病中的临床反应存在差异。此外，LD-IL-2 在同种免疫疾病中的疗效有限。未来需进一步研究确定其治疗效果的持续时间，以及能否预防链球菌抗原反复暴露后的异常反应。总体而言，LD-IL-2 疗法有望成为治疗 ARF 的有效手段，改善临床结局，减少 RHD 相关的心脏并发症，甚至可能取代标准的每月青霉素注射。