靶向淋病奈瑟菌 Ⅳ 型菌毛的天然化合物研究新进展：石榴皮苷和诃子酸的关键作用

本文发现石榴皮苷和诃子酸可抑制淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae）Mpg 酶活性，影响 Ⅳ 型菌毛（T4p）表达，有望抗定植和抗毒力。

　　

一、研究背景

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）作为淋病的主要致病菌，给全球健康带来沉重负担。它的传播率高，且耐药问题日益严重，对一线推荐抗生素头孢曲松的耐药现象广泛出现。多数淋病感染无症状，这使得其传播难以控制，而长期感染会给女性带来严重生殖健康问题，如盆腔炎、不孕、异位妊娠和早期流产等，在男性和女性中还可能引发播散性淋球菌感染，导致感染性关节炎、心内膜炎等并发症。此外，既往感染不会使人体产生对未来感染的免疫力。

淋病奈瑟菌感染分为粘附、定植和侵袭三个步骤，其中 Ⅳ 型菌毛（Type IV pilus，T4p）在感染过程中起着关键作用。T4p 是重要的定植和毒力因子，它不仅介导细菌与宿主细胞的粘附，促进 DNA 摄取、实现菌毛运动，还能帮助细菌抵抗多形核细胞（PMN）的杀伤。从感染患者体内分离出的淋病奈瑟菌通常带有菌毛，这凸显了 T4p 在感染中的重要性。因此，T4p 成为新型抗菌化合物治疗淋病的极具吸引力的靶点。

此前已有研究致力于发现针对脑膜炎奈瑟菌 T4p 的新型抗菌化合物，例如发现了三氟拉嗪和硫利达嗪等，它们可降低 T4p 功能并减轻病理，但并非直接作用于 T4p；还有研究鉴定出三种针对 T4p PilF 延伸 ATPase 的化合物，能阻止 T4p 的组装。研究还发现 M23B 类锌金属肽酶 Mpg（由NGO_1686基因座编码）对 T4p 的产生和 T4p 介导的抗 PMN 杀伤至关重要，Mpg 在周质中发挥作用，参与细菌肽聚糖（PG）的修饰过程，其锌依赖性羧肽酶和内肽酶活性影响菌毛生物合成，却不影响细胞形态。基于此，本研究旨在通过高通量靶向筛选，寻找 Mpg 的抑制剂，进而发现针对淋病奈瑟菌 T4p 的新型抗菌化合物。

二、研究方法

1. 化合物筛选：利用荧光热漂移（FTS）测定法对 37,760 种化合物进行筛选。该方法通过监测蛋白质热变性过程中与环境敏感染料（如 Sypro - Orange）结合导致的荧光变化，来判断小分子与目标蛋白（Mpg）的结合情况。当小分子结合到 Mpg 上时，会使 Mpg 的热变性温度（Tm）发生变化，从而筛选出潜在的活性化合物。
2. 酶活性测定：使用染料标记的 PG，通过监测可溶性染料标记的 PG 从聚合物中释放的情况，来评估 Mpg 的 PG 水解活性，以及石榴皮苷和诃子酸对其活性的影响。
3. 分子对接：运用 AutoDock4 和 AutoDock Vina 软件，结合 Mpg 的晶体结构（PDB 6muk）进行分子对接研究，以确定化合物与 Mpg 的潜在结合位点。同时，利用 AlphaFold 预测 Mpg 与化合物之间的相互作用，进一步验证结合位点。
4. 细菌实验：选用多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中 Mpg 的同源物进行研究，表达并纯化这些同源蛋白，通过体外酶促反应检测石榴皮苷和诃子酸对它们的抑制活性。对淋病奈瑟菌进行处理，通过菌毛依赖的菌落形态测定、免疫金透射电子显微镜（immunogold - TEM）等实验，观察化合物对菌毛表达的影响。还进行了转化效率测定、LL - 37 敏感性测定、抗生素敏感性 E - tests 等实验，评估化合物对淋病奈瑟菌其他相关表型的影响。
5. 细胞实验：使用原代男性尿道细胞（UECs）和宫颈（Pex）上皮细胞，研究化合物处理后淋病奈瑟菌对这些细胞的粘附和存活情况。同时，在 HeLa 细胞、UECs 和 Pex 细胞中检测化合物的细胞毒性和对细胞代谢活性的影响。

三、研究结果

1. 化合物筛选结果：通过 FTS 筛选，从 37,760 种化合物中鉴定出 182 种初级命中化合物，其中石榴皮苷和诃子酸表现出对 Mpg 的显著作用。石榴皮苷和诃子酸是天然存在的属于鞣花单宁家族的化合物，分别大量存在于石榴和诃子树果实中。在剂量反应实验中，它们呈现出剂量依赖性的 Tm 变化，5μM 浓度时，石榴皮苷使 Tm 下降 4.4°C，诃子酸使 Tm 下降 2.9°C，表明它们与 Mpg 结合并使 Mpg 结构不稳定。体外酶活性实验显示，随着石榴皮苷和诃子酸浓度增加，Mpg 的 PG 水解活性呈剂量依赖性降低，10μM 时大部分活性被抑制。
2. 结合位点研究结果：分子对接研究发现，石榴皮苷和诃子酸可与 Mpg 结合在三个位点。位点 1 位于含 Zn2?的活性位点，该位点在肽酶 M23B 家族中保守，结合在此处可能破坏 Zn2?结合；位点 2 和位点 3 位于位点 1 的背面，在一个长凹槽内，结合在此处可能干扰 Mpg 与 PG 的相互作用，影响内肽酶活性。AlphaFold 预测结果进一步证实了这些结合位点。
3. 对 Mpg 同源物的活性结果：在革兰氏阴性菌中，石榴皮苷和诃子酸对N. meningitidis和A. baumannii的 Mpg 同源物 PG 水解活性有显著抑制作用；对P. aeruginosa的同源物活性也有一定程度降低；E. coli和V. cholerae的同源物对石榴皮苷更为敏感。在革兰氏阳性菌中，它们对Staphylococcus aureus的 G - G 内肽酶抑制作用更显著，对 LytM1 蛋白抑制作用较弱。
4. 对淋病奈瑟菌菌毛表达的影响结果：使用菌毛依赖的菌落形态测定和 immunogold - TEM 实验表明，1μM 的石榴皮苷或诃子酸处理淋病奈瑟菌后，菌株的菌毛化菌落形态转变为低菌毛化，与mpg突变体相似，细胞表面的菌毛数量明显减少，说明这些化合物能进入细菌周质抑制 Mpg，进而降低 T4p 在细胞表面的表达。
5. 对淋病奈瑟菌其他表型的影响结果：石榴皮苷和诃子酸处理淋病奈瑟菌后，对其转化效率和对 LL - 37 介导的杀伤敏感性均无显著影响。在细胞感染模型中，1 - 4μM 的化合物可显著降低淋病奈瑟菌对 UECs 和 Pex 细胞的粘附能力，在 24 小时感染实验中，几乎完全抑制了淋病奈瑟菌在这些细胞中的存活。
6. 细胞毒性和代谢活性影响结果：在 HeLa 细胞、UECs 和 Pex 细胞实验中，浓度高达 5μM 的石榴皮苷和诃子酸对细胞代谢活性无明显影响，也未表现出细胞毒性。在更高浓度（8μM）时，对 UECs 和 Pex 细胞活力有小幅度但显著的降低。

四、研究结论

本研究利用高通量筛选方法，成功鉴定出石榴皮苷和诃子酸这两种天然化合物，它们能够结合并抑制 Mpg 的活性。通过分子对接研究，初步确定了它们与 Mpg 的结合位点，推测可能通过阻断活性位点来抑制 Mpg 的 PG 水解活性。这两种化合物不仅对淋病奈瑟菌的 Mpg 有抑制作用，对其他细菌中 Mpg 的同源物也表现出活性，表明它们具有潜在的广泛抗菌作用。

在淋病奈瑟菌感染过程中，石榴皮苷和诃子酸能够降低菌毛表达，显著抑制细菌对宿主细胞的粘附和在细胞内的存活，这对于阻止淋病奈瑟菌的定植和发病机制具有重要意义。同时，它们在较低浓度下对宿主细胞无明显毒性，这为开发新型抗淋病药物提供了有价值的线索。

然而，这两种化合物在动物模型中半衰期较短，石榴皮苷还易被代谢，这限制了它们直接作为治疗淋病的药物。但研究发现石榴皮苷的一些代谢产物组合对 Mpg 仍有活性，这提示即使石榴皮苷被代谢，仍可能在感染治疗中发挥作用。未来研究可基于这些发现，进一步优化化合物结构，开发更稳定、有效的抗毒力和抗定植药物。此外，虽然本研究未发现这两种化合物与头孢曲松联合使用时有明显协同作用，但仍需深入研究它们在抑制细菌感染方面与其他抗生素联合使用的可能性，为应对淋病奈瑟菌感染提供更多治疗选择。

总体而言，本研究为靶向淋病奈瑟菌 T4p 的药物研发提供了新的思路和潜在的化合物，对未来抗淋病药物的开发具有重要的指导意义。