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为解决桃与褐腐病菌（Monilinia laxa）互作研究中内参基因（RGs）未确立的问题，CREA - 研究中心的研究人员筛选 12 个候选 RGs，发现 AKT3、RPII 和 SNARE 最稳定，为精准分析提供依据。
研究背景
在水果的世界里，桃子凭借鲜美多汁的口感深受人们喜爱。然而，一种名为褐腐病菌（Monilinia laxa）的真菌，却如同潜伏在桃子身边的 “杀手”，严重威胁着桃子的产量和品质。这种病菌引发的褐腐病，在适宜的环境条件下，能让桃子在收获前和收获后遭受重创，经济损失可超过 50%，极端情况下甚至高达 100%。
为了应对这一难题，科研人员积极探索桃子与褐腐病菌之间的 “战争” 奥秘，试图找出桃子抵抗病菌的关键机制，进而培育出更具抗性的品种。基因表达分析在揭示植物 - 病原体互作机制中起着关键作用，而逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）作为一种常用的基因表达分析技术，其准确性依赖于合适的内参基因（RGs）。遗憾的是，在桃与褐腐病菌互作的研究中，RGs 却尚未确立。不同的研究使用的 RGs 各不相同，且其稳定性在不同的实验条件下也存在差异，这使得研究结果的准确性和可靠性大打折扣。因此，筛选出在桃与褐腐病菌互作体系中稳定的 RGs 迫在眉睫。
CREA - 研究中心（Research Centre for Olive, Fruits and Citrus Crops）的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》期刊上，为深入了解桃与褐腐病菌的互作机制带来了新的曙光。
研究方法
研究人员选用 “Fairtime” 品种的桃果实和从患病果实中分离出的褐腐病菌进行实验。他们精心设计实验，设置多个时间点采集样本，包括接种前以及接种后 12、24、72、96、120 和 144 小时（HAI），同时设置对照样本。
在实验技术方面，主要运用了以下几种关键技术：首先是总 RNA 提取及 cDNA 合成技术，从桃子样本中提取总 RNA，经处理去除基因组 DNA 污染后，合成单链 cDNA，为后续实验提供材料；其次是利用 Primer Expression Software version 3 设计特定的引物，用于扩增 12 个候选 RGs 和 6 个目标基因（GOIs）；然后通过 RT - qPCR 技术检测基因表达情况，并借助 ΔCq 方法、BestKeeper、NormFinder 和 geNorm 算法评估 RGs 的稳定性；最后运用比较 2-ΔΔCt 方法分析 GOIs 的相对表达水平，以此验证所选 RGs 的稳定性和可靠性。
研究结果
- RGs 的筛选及引物检测：研究人员挑选了 12 个候选 RGs，通过 2% 琼脂糖凝胶电泳和熔解曲线分析，证实每个引物对都具有特异性，且 PCR 扩增效率在 100.9% - 109.8% 之间，回归系数在 0.989 - 1.00 之间，表明这些候选 RGs 适合用于 RT - qPCR 分析。
- RGs 的表达谱分析：通过原始定量循环（Cq）值评估候选 RGs 的表达水平，发现 IF1A 表达水平最高，CYP2 表达水平最低。SNARE、AKT3 和 18S 的基因表达变化最小，而 TUB1 的变化最大。
- RGs 的稳定性分析：运用四种统计方法对 12 个候选 RGs 进行稳定性分析，结果显示不同算法得到的 RGs 稳定性排名有所差异。geNorm 分析表明所有测试的 RGs 方差都很小，M 值均低于 1.5，其中 AKT3 和 RPII 最为稳定，且通过计算发现三个 RGs 即可满足归一化需求；NormFinder 分析得出 RPII 最稳定；BestKeeper 分析指出 AKT3 和 SNARE 稳定性最佳；ΔCq 方法则认为 RPII 最稳定。综合四种算法的结果，RPII、AKT3 和 SNARE 被确定为最稳定的 RGs，而 TUA5、UBQ10 和 TUB1 则是最不稳定的。
- 目标基因表达分析：为了验证所选 RGs 的有效性，研究人员对 6 个参与不同代谢途径的 GOIs 进行了表达研究。结果发现，使用最稳定的 RGs 进行归一化时，WRKY 基因在接种后 24、96、120 和 144 小时显著上调；POX73 在多个时间点也呈现上调趋势；BON1、ACC、THAU1 和 PAL 等基因同样表现出特定的表达变化规律。而当使用最不稳定的 RGs 进行归一化时，这些基因的表达趋势和变化倍数与前者存在明显差异。
研究结论与意义
本研究成功筛选出在桃与褐腐病菌互作体系中最稳定的 RGs——RPII、AKT3 和 SNARE。这些稳定的 RGs 能够确保在研究桃与褐腐病菌互作过程中，RT - qPCR 数据归一化的准确性和可靠性，为精确测量基因表达变化提供了有力保障。这不仅有助于深入理解桃子抵抗褐腐病菌的分子机制，推动桃病理学研究的发展，还能为其他植物 - 病原体互作研究中 RGs 的选择提供重要参考，在更广泛的基因表达研究领域具有重要的应用价值。它为培育抗褐腐病的桃子新品种奠定了坚实的理论基础，有望在未来减少褐腐病对桃子产业造成的巨大损失。
