通过反向三羧酸循环途径改造大肠杆菌实现化学自养条件下碳通量重编，助力二氧化碳固定研究

为探究异养大肠杆菌利用反向三羧酸循环（rTCA）固定 CO2的条件及碳流分配，国立中兴大学的研究人员开展相关研究，发现 KOR 和 ACL 可助力 CO2同化及碳通量重编，为碳固定和生物技术创新提供思路。

　　

研究背景

在全球积极追求 2050 年实现净零碳排放的宏大目标下，二氧化碳（CO₂）固定成为生命科学领域备受瞩目的焦点。这就好比在一场应对气候变化的 “战斗” 中，CO₂固定是一把至关重要的 “武器”。开发 CO₂固定的遗传途径和重新配置碳通量，成为了科研人员们亟待攻克的难题。

自然界中，自养细菌虽能通过 CO₂固定为异养生物提供有机碳，可它们的碳固定效率有限、生长缓慢，还对极端环境条件有很强的依赖性，就像被束缚在特定环境中的 “小马拉大车”，难以成为高效的细胞工厂。相比之下，大肠杆菌（E. coli）凭借快速生长、底物利用广泛和易于遗传操作等优势，成为了代谢工程应用中的 “潜力股”。

在众多的自养碳固定途径里，反向三羧酸循环（rTCA）备受关注。它在微生物的 CO₂固定中展现出较高的效率，甚至被认为可能是生命起源时最早的自养代谢方式。α- 酮戊二酸：铁氧还蛋白氧化还原酶（KOR）和 ATP 依赖的柠檬酸裂解酶（ACL）是 rTCA 循环中的关键酶，然而此前它们在重编碳通量方面的具体作用尚未完全明确。

为了深入了解异养大肠杆菌利用 rTCA 机制固定 CO₂所需的最小基因集、营养条件，以及在此过程中碳流的走向和关键代谢通量的分配情况，国立中兴大学的研究人员开展了这项意义重大的研究。

研究方法

1. 构建转基因菌株：研究人员对之前的 Ordered Gene Assembly in the Bacillus subtilis（OGAB）方法加以改进，构建了表达 KOR 和 ACL 的转基因大肠杆菌菌株。
2. 微生物培养与计数：将构建好的大肠杆菌菌株在特定条件下培养，通过测量光密度或计算菌落形成单位来评估细菌的生长情况。
3. 酶活性测定：对培养的大肠杆菌菌株进行处理，获取粗蛋白，采用特定的方法测定 α- 酮戊二酸氧化还原酶、异柠檬酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶和琥珀酰辅酶 A 合成酶等关键酶的活性。
4. 代谢物分析：运用同位素标记、气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）等技术，对 TCA 循环代谢物、短链脂肪酸、脂肪酸、氨基酸以及脱氧核糖核酸代谢物等进行提取、衍生化处理，进而分析其富集情况和浓度。
5. 统计分析：使用 Student’s t 检验、Mann-Whitney U 检验和单因素方差分析（ANOVA）等统计方法，对实验数据进行分析，判断结果的统计学意义。

研究结果

1. KOR 支持大肠杆菌在化学自养模式下的细胞维持：构建转基因菌株后进行转录组分析，结果显示 K 和 KA 菌株中异源基因表达良好。酶活性测定表明，K 和 KA 菌株中 KOR 编码的 α- 酮戊二酸氧化还原酶活性显著高于对照菌株。在化学自养条件下，KOR 表达菌株（K 和 KA）在有 CO₂供应时，微生物数量增加，而对照菌株则无法生长，这表明 KOR 可通过氢驱动的厌氧呼吸支持细胞维持。
2. KOR 显著增强 CO₂在 TCA 循环代谢物中的掺入：在有机碳源缺乏的条件下，用¹³CO₂对 K 和 KA 菌株进行培养。与 KA 菌株相比，K 菌株中¹³CO₂在柠檬酸、琥珀酸、丙酮酸等 TCA 循环代谢物中的富集度更高，说明 KOR 单独表达能有效增强 TCA 循环中碳通量的保留，而 ACL 的添加可能会使碳流从 TCA 循环转移出去。
3. 额外表达 ACL 重编 CO₂的碳通量：尽管计算机模拟模型预测同时表达 KOR 和 ACL 的菌株中 TCA 循环的 CO₂通量更高，但稳定同位素示踪实验结果却与之不同。实验表明，表达 ACL 的转基因大肠杆菌在 TCA 循环中积累的 CO₂通量比仅表达 KOR 的菌株少，ACL 似乎将 CO₂通量重定向到草酰乙酸和天冬氨酸。
4. 共表达 KOR 和 ACL 对脂肪酸合成影响有限：研究人员探究了 ACL 表达对转基因菌株脂肪酸合成的影响，结果发现，在厌氧条件下，KA 菌株与对照菌株的脂肪酸和短链脂肪酸（SCFAs）浓度并无差异，这表明 ACL 表达在这种环境下并未促进脂肪酸合成。
5. ACL 和 KOR 表达助力 CO₂在蛋白质生物合成中的固定：通过追踪细胞蛋白质生物合成中的碳通量，发现 KA 菌株相较于 K 菌株，细胞蛋白质水解产物中的氨基酸富集度有所提高，这表明共表达异源 KOR 和 ACL 促进了 CO₂在蛋白质生物合成中的掺入。
6. ACL 和 KOR 表达助力 CO₂在核苷酸生物合成中的固定：对核苷酸生物合成的研究发现，与对照菌株和 K 菌株相比，KA 菌株中脱氧胸苷（dT + 1）、脱氧胞苷（dC + 1）等核苷酸的同位素富集度显著增加，说明 KOR 和 ACL 的共表达促进了 CO₂在嘧啶和嘌呤生物合成中的掺入。

研究结论与意义

这项研究首次成功构建出能在化学自养条件下利用氢驱动的厌氧呼吸维持细胞生长的固碳大肠杆菌菌株。研究表明，单独表达 KOR 或共表达 KOR 和 ACL 都足以支持大肠杆菌在化学自养条件下的细胞维持和 CO₂同化。KOR 促进 CO₂同化并将碳通量保留在 TCA 循环中，而 ACL 则进一步将碳通量导向蛋白质和核苷酸生物合成等重要细胞过程。这些工程化的代谢途径代表了维持细胞生命的基本和最小配置，反映了生存所需的核心代谢功能。

不过，目前要实现大肠杆菌以 CO₂为唯一碳源的无限生长仍面临挑战。研究人员推测，主要限制因素可能是在营养匮乏条件下，还原型铁氧还蛋白的供应不足，无法维持 KOR 的活性。未来研究可围绕提高还原型铁氧还蛋白的可用性展开，这有望推动转基因菌株在完全无有机碳源环境中实现完全自养生长。该研究成果为碳固定和生物技术创新开辟了新道路，在可持续发展领域具有重要的潜在应用价值。