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为探究 RGP1 和 RGP2 在海星中的作用机制，澳大利亚弗洛里研究所等机构研究人员开展相关研究，发现其受体为 RXFP/LGR3，这为理解松弛素信号通路演化提供新视角。
一、研究背景
在生物的奇妙世界里，生殖过程的调控机制一直是科学家们热衷探索的神秘领域。松弛素（Relaxin）作为一种在脊椎动物生殖生理调控中发挥重要作用的肽类家族，自 1926 年在怀孕豚鼠和兔子血液中被发现能使耻骨联合韧带松弛以来，其神秘面纱逐渐被揭开。后续研究表明，它是一种源自卵巢黄体的肽，由两条肽链（A 链、B 链）通过二硫键连接而成，属于胰岛素样分子。随着研究的深入，一系列松弛素样肽在哺乳动物中被发现，包括松弛素 1 - 3（RLN1 - 3）和胰岛素样肽 3 - 6（INSL3 - 6），它们不仅参与生殖调控，还在胃肠道、心血管功能、代谢和应激等多种生理过程中发挥作用。
在发现松弛素家族肽的同时，其作用机制也成为研究热点。通过基因敲除小鼠实验，科学家发现胰岛素样肽 3（INSL3）和富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体 8（LGR8）基因敲除小鼠出现睾丸下降异常的表型，从而证实 LGR8 是松弛素的受体，随后更多松弛素受体如 LGR7、GPCR135 和 GPCR142 也相继被发现，它们分别被命名为松弛素家族肽（RXFP）受体 1 - 4。与胰岛素和胰岛素样生长因子（IGFs）通过结合酪氨酸激酶型受体发挥作用不同，松弛素家族肽通过结合 G 蛋白偶联受体（GPCRs）发挥生理效应，这一独特的作用方式引起了科学家们浓厚的兴趣。
果蝇作为模式生物，为松弛素信号通路的演化研究提供了重要线索。研究发现，人类的 RXFP1 和 RXFP2 是果蝇受体 LGR3 的共同直系同源物，果蝇胰岛素样肽 8（Dilp8）能与 LGR3 结合，调节果蝇的生长、成熟和生殖行为。此外，果蝇中的另一种胰岛素样肽 Dilp7 能与 LGR4 结合，参与幼虫的避光行为调控。这些研究表明，松弛素 / 胰岛素相关肽作为 GPCRs 的配体，在进化上是古老的调控因子，参与多种生理过程。
然而，在无脊椎动物中，GPCR 介导的松弛素 / 胰岛素样信号的存在和功能仍有待进一步探索。海星作为棘皮动物门的代表生物，其生殖调控机制一直是个谜。1959 年，科学家发现海星的放射神经索提取物能触发产卵，后来这种促性腺物质被命名为促性腺刺激物质（GSS），并被证实是一种通过刺激卵巢滤泡细胞产生 1 - 甲基腺嘌呤，进而触发卵母细胞生发泡破裂和产卵的肽。直到 2009 年，GSS 被鉴定为松弛素样肽，并更名为松弛素样促性腺肽（RGP）。随后，在海星中又发现了第二种松弛素样肽（RLP2），现被命名为 RGP2，它也具有促性腺活性。至此，海星中 RGP1 和 RGP2 的发现为研究松弛素样肽在无脊椎动物中的作用提供了新的契机，但它们在海星中的作用机制以及相关受体仍不清楚，这也促使研究人员开展深入研究。
二、研究机构与研究目的
为了揭开海星中 RGP1 和 RGP2 的神秘面纱，澳大利亚弗洛里研究所（The Florey Institute）等机构的研究人员展开了一系列深入研究。他们旨在通过详细分析松弛素型前体在棘皮动物和其他两侧对称动物门中的系统发育分布和关系，探究这些神经肽的演化历程；同时，通过鉴定 RGP1 和 RGP2 的候选受体，揭示它们在海星中发挥促性腺作用的分子机制。研究成果为理解松弛素型信号作为生殖生理调节因子的演化提供了新的视角，相关研究发表在《BMC Biology》期刊上。
三、研究方法
研究人员运用了多种先进技术方法。在序列分析方面，通过 tBLASTn 分析 GenBank 核苷酸序列数据，结合本地 BLAST 分析特定物种基因组序列，筛选出松弛素 / 胰岛素相关肽前体和松弛素型 GPCRs 的序列。利用 CLANS 和系统发育分析方法，研究这些序列之间的进化关系。通过 MAFFT7 和 BOXSHADE 对肽链序列进行比对和分析，揭示序列的相似性和差异。借助 Splign 工具和 IBS 1.0 软件，研究基因的外显子 / 内含子结构。在功能验证方面，合成 RGP1 和 RGP2 等相关肽，克隆编码受体的 cDNA 到哺乳动物表达质粒中，进行细胞培养和转染。运用受体表达分析、CRE 报告基因检测、基于发光的检测等实验，检测受体与配体的相互作用。此外，还通过体外产卵实验，研究 RGP1 和 RGP2 对海星卵巢的影响。
四、研究结果
- 海星 RGP1 和 RGP2 与其他类群松弛素 / 胰岛素 / IGF 型肽的关系：通过 CLANS 和系统发育分析发现，海星 RGP1 和 RGP2 前体与其他棘皮动物的松弛素样肽前体以及脊索动物的松弛素型前体聚类在一起，且在更广泛的松弛素 / 胰岛素 / IGF 型肽前体家族中，松弛素 / Dilp8 型前体与 Dilp7 型前体关系密切。基因结构分析表明，海星 RGP1 和 RGP2 前体基因具有与其他类群松弛素型前体基因相似的内含子结构，且存在一些特征性差异，如 Dilp7 型前体基因具有额外的内含子。此外，对 A 链和 B 链序列的分析发现，RGP2 B 链存在独特的丙氨酸残基，A 链具有特定的 Gly - Ile（GI）基序。
- 海星中 RGP1 和 RGP2 候选受体的鉴定：通过对海星转录组 / 基因组序列数据的分析，研究人员发现了编码哺乳动物松弛素型受体 RXFP1 - 4 和果蝇 LGR3/LGR4 型受体同源物的基因。进一步的 CLANS 和系统发育分析揭示，海星和其他棘皮动物有两种富含亮氨酸重复序列的 GPCRs，分别为 RXFP/LGR3 和 LGR4。基因结构分析为它们的进化关系提供了进一步证据，表明 RXFP/LGR3 型基因和 LGR4 型基因是通过古老的基因复制事件演化而来的旁系同源基因。基于这些分析，研究人员推测 AsolRXFP/LGR3 和 ArubRXFP/LGR3 可能是 RGP1 和 RGP2 的受体。
- 海星和其他类群中 RXFP/LGR3 型和 LGR4 型蛋白的结构特征比较：对不同物种中 RXFP/LGR3 型和 LGR4 型蛋白的结构分析发现，AsolRXFP/LGR3 和 ArubRXFP/LGR3 存在不同的信号肽结构，前者具有典型的 N 端信号肽，而后者的 N 端信号肽为内部信号肽，这一特征在环节动物 O. fusiformis 的 LGR3 中也存在。LGR4 型蛋白在海星和其他物种中都具有潜在的 N 端信号肽，且存在可变剪接产生的不同亚型。此外，RXFP/LGR3 和 LGR4 在细胞外 N 端区域都具有低密度脂蛋白受体 A 类（LDLa）模块。
- RGP1 和 RGP2 作为海星 RXFP/LGR3 型受体的配体：实验结果表明，在 A. cf. solaris 中，RGP1 能诱导表达 AsolRXFP/LGR3 的细胞产生浓度依赖性的 cAMP 活性，RGP2 在高浓度下也能激活该受体；而在表达 AsolLGR4 的细胞中，RGP1 和 RGP2 均无明显作用。在 A. rubens 中，RGP1 和 RGP2 能与 ArubRXFP/LGR3 结合并触发发光反应，且 EC50 值表明 RGP1 的亲和力更强；而在表达 ArubLGR4 的细胞中，未观察到 RGP1 和 RGP2 的作用。此外，对 ArubRXFP/LGR3 进行修饰后，RGP1 和 RGP2 仍能与之结合，且其表达不受内部信号肽的影响。
- AsolRGP1 和 AsolRGP2 在 A. cf. solaris 中的促性腺活性：体外实验表明，RGP1 和 RGP2 都具有促性腺活性，能诱导 A. cf. solaris 卵巢成熟卵子的脱落，但 RGP2 的效力略低于 RGP1。对 AsolRGP2 进行修饰后，其效力进一步降低。
五、研究结论与讨论
研究人员成功鉴定出海星中被松弛素样促性腺肽激活的 RXFP/LGR3 型 G 蛋白偶联受体，这一发现为理解两侧对称动物中松弛素型信号作为生殖过程调节因子的演化提供了新的关键线索。通过系统发育分析，明确了 RGP1 和 RGP2 属于松弛素型肽家族，其演化可追溯到原口动物和后口动物的共同祖先，且基因复制事件在其演化中起到重要作用。实验证实 RXFP/LGR3 是 RGP1 和 RGP2 的生理受体，纠正了之前关于 RGP1 与 LGR4 结合的错误认知，为后续研究提供了准确的方向。
此外，研究还发现不同物种中 RXFP/LGR3 型受体信号肽结构的差异，这为深入研究蛋白质进化提供了新的视角。从比较生理学角度来看，松弛素型信号在果蝇和海星的生殖系统中都发挥着重要作用，分别调节产卵和卵母细胞排放，这表明其在生殖调控中的功能具有进化上的保守性。研究人员推测，在保留松弛素 / Dilp8 - RXFP/LGR3 型信号的无脊椎动物中，该信号系统可能参与生殖过程的调控，这为未来在其他物种中的研究提供了重要的理论基础。
