《Cancer Gene Therapy 》新型腺病毒载体为肌肉浸润性膀胱癌治疗带来新希望

为解决肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）治疗难题，神户大学研究人员开展了针对新型腺病毒载体治疗 MIBC 的研究，发现 CRAd-synNotch 显著抑制肿瘤生长，为 MIBC 治疗提供新方向。

　　

肌肉浸润性膀胱癌（Muscle-invasive bladder cancer，MIBC）是一种令人头疼的恶性肿瘤，在全球癌症发病率排名中位列第十。它就像一个狡猾的 “敌人”，具有极高的异质性，基因组不稳定且突变率高，治疗起来困难重重。目前，根治性膀胱切除术是 MIBC 的标准治疗方案，但患者的 5 年生存率仅约 50% ，对于转移性疾病患者，这一数字更是低于 10%。即便近年来涌现出一些新的治疗方法，如针对成纤维细胞生长因子受体（FGFR）的疗法、抗程序性死亡受体 - 1（PD-1）/ 程序性死亡配体 1（PD-L1）抗体以及抗体偶联药物等，根治性膀胱切除术依旧是主要治疗手段。由此可见，探寻更有效的 MIBC 治疗方法迫在眉睫。

癌症干细胞（Cancer stem cells，CSCs）在 MIBC 的频繁复发、转移和高发病率中扮演着关键角色。其中，CD44 作为癌细胞表面的一种受体，与细胞外基质蛋白结合，被视为膀胱癌干细胞（BCSCs）的标志物，它与肿瘤的转移能力和干性密切相关，还与患者的不良预后紧密相连。此外，几乎所有实体瘤都存在缺氧微环境，缺氧诱导因子 - 1（HIF-1）在膀胱癌的缺氧适应性反应中起核心调节作用，促进肿瘤发生和 CSC 维持。因此，针对 CSCs，尤其是同时靶向 CD44 和 HIF 信号通路的治疗策略，有望为 MIBC 患者带来新的生机。

基于此，神户大学的研究人员开展了一项极具意义的研究，旨在探索新型治疗手段对 MIBC 的疗效。他们构建了一种条件复制型腺病毒载体（CRAd-synNotch），该载体携带由 COX-2 启动子驱动的腺病毒 E1 基因、synNotch 受体治疗基因以及 Ad5/35 纤维基因。研究发现，CRAd-synNotch 在体内外实验中展现出强大的抗肿瘤活性，这一成果为 MIBC 的治疗开辟了新的方向。该研究成果发表于相关领域专业期刊。

为开展此项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。细胞实验方面，培养多种细胞系，包括人 MIBC 细胞系 T24、人尿路上皮细胞系 SV-HUC-1 等，为后续实验提供细胞模型。在病毒载体构建上，构建了 CRAd-synNotch 和对照载体 CRAd-GFP，并对其进行鉴定。动物实验中，利用 T24 细胞构建小鼠异种移植模型，用于评估载体的体内抗肿瘤效果。检测分析技术上，采用流式细胞术检测细胞表面受体表达，蛋白质免疫印迹法（Western blotting）分析蛋白表达，实时逆转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）检测基因表达，免疫组化染色观察肿瘤组织相关蛋白表达情况。

研究结果如下：

• 细胞表面受体及相关基因表达：通过流式细胞术和 Real-time RT-PCR 检测发现，T24 细胞表达柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）、CD46、CD44，以及透明质酸合成酶（HAS1、HAS3）和 COX-2 mRNA。这表明 T24 细胞具备与腺病毒结合的受体，且其细胞特性与肿瘤增殖和转移相关，为后续研究腺病毒载体对 T24 细胞的作用奠定基础。

• 病毒载体复制特性：将 wtAd、ADX730、CRAd-GFP 和 CRAd-synNotch 分别感染不同细胞系，通过定量 PCR 评估病毒 DNA 拷贝数。结果显示，CRAd-synNotch 和 CRAd-GFP 在 T24 细胞中拷贝数增加，而在 COX-2 阴性的 BT474 细胞中未增加，表明 CRAd-synNotch 以 COX-2 依赖的方式复制。这一特性使得 CRAd-synNotch 能够在高表达 COX-2 的肿瘤细胞中特异性复制，发挥抗肿瘤作用。

• synNotch 受体蛋白及基因转导：利用 Western blotting 和 Real-time RT-PCR 技术检测发现，CRAd-synNotch 和 ADX730 均可在 T24 细胞中转导 synNotch 受体蛋白和 HIF-3α4 基因。这意味着两种载体能够将治疗基因导入 T24 细胞，为抑制肿瘤细胞生长提供可能。

• 细胞生长抑制作用：细胞增殖实验表明，CRAd-synNotch 和 ADX730 在常氧和缺氧条件下均能显著抑制 T24 细胞生长，且 CRAd-synNotch 的抗肿瘤效果更优，但二者对 BT474 细胞无明显抑制作用。这说明两种载体对肿瘤细胞的抑制作用具有特异性，与肿瘤细胞的特性密切相关。

• 对相关基因表达的影响：在缺氧培养条件下，Real-time RT-PCR 检测显示，CRAd-synNotch 和 ADX730 显著抑制 T24 细胞中 CD44 下游基因（如 SOX-2、Cortactin、OCT4、Nanog、c-Myc 和 Cyclin-d1）和 HIF 靶基因（如 VEGF、PHD3、Bcl-xL、CyclinG2 和 GLUT1）的 mRNA 表达。这些基因与肿瘤细胞的干性、增殖、侵袭和代谢密切相关，抑制它们的表达有助于抑制肿瘤生长。

• 体内抗肿瘤效果：通过构建 T24 小鼠异种移植模型，研究人员发现，瘤内注射 CRAd-synNotch 和 ADX730 可诱导肿瘤细胞膜上 CD44 过表达。同时，CRAd-synNotch 显著抑制 T24 异种移植瘤的生长，并延长小鼠生存时间。这进一步证实了 CRAd-synNotch 在体内的抗肿瘤活性，为其临床应用提供了有力依据。

在讨论部分，研究人员指出，CRAd-synNotch 结合了溶瘤腺病毒和 synNotch 受体的优势。溶瘤腺病毒能够在肿瘤细胞中复制并裂解细胞，释放的病毒可继续感染其他肿瘤细胞，还能引发免疫原性细胞死亡，激活免疫系统对抗肿瘤。而 synNotch 受体可抑制 CD44 和 HIF 信号通路，有效抑制肿瘤干细胞的活性。不过，该研究也存在一定局限性，如使用免疫缺陷的裸鼠模型无法评估对载体和转基因的免疫反应，且未能明确 Ad5/35 纤维的作用。尽管如此，研究人员开发的 CRAd-synNotch 和 ADX730 为 MIBC 的治疗带来了新的希望。这两种载体在体内外实验中均表现出良好的抗肿瘤效果，尤其是 CRAd-synNotch，具有较高的临床应用潜力，有望为 MIBC 患者提供更有效的治疗方案，推动 MIBC 治疗领域的发展。