编辑推荐：
为解决单克隆抗体（mAbs）生成及稳定性问题，日本研究人员开展 AID2 细胞用于 ADLib 系统的研究，成功稳定抗原特异性克隆，助力 mAbs 高效生产。
在生物医学的舞台上，单克隆抗体（mAbs）可谓是熠熠生辉的 “明星分子”，它广泛应用于实验试剂、疾病诊断以及临床治疗等诸多关键领域。想象一下，在疾病诊断中，它能像精准的 “侦探” 一样，迅速且准确地识别出病原体；在治疗时，又如同 “智能导弹”，精准地攻击病变细胞，对正常细胞却 “秋毫无犯”。然而，生成高质量、特异性强且稳定的 mAbs，一直是科研人员面临的巨大挑战。
传统的杂交瘤技术就像一位 “老将”，虽为 mAbs 的生成立下了汗马功劳，但随着时代的发展，它的局限性也逐渐暴露出来。一方面，免疫耐受性使得那些进化上保守的抗原免疫原性极低，想要针对它们生成 mAbs，简直难如登天；另一方面，《动物福利法》等法规的出台，限制了实验动物的使用，科研人员不能再像以前一样，随意牺牲大量实验动物来获取 mAbs。
为了突破这些困境，体外方法如噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示等应运而生。但这些方法就像带着镣铐跳舞，操作繁琐不说，耗时还特别长。在这样的背景下，日本的研究人员挺身而出，开展了一项意义非凡的研究，相关成果发表在Communications Biology上。
研究人员将目光聚焦在之前开发的 ADLib 系统上，该系统利用禽类来源的 B 细胞系 DT40，借助基因转换（一种同源重组方式，可使禽类免疫球蛋白（Ig）基因多样化）来生成 mAbs。然而，美中不足的是，即使在去除曲古抑菌素 A（TSA，一种能增强基因转换频率的组蛋白去乙酰化酶抑制剂）后，低频的自发基因转换依然存在，这就像一颗 “定时炸弹”，可能会导致筛选出的抗原特异性克隆的特异性逐渐改变。
为了解决这个棘手的问题，研究人员巧妙地构建了激活诱导脱氨酶（AID，基因转换的启动因子）的条件突变体 ——AID2 细胞，利用辅助素诱导降解系统，通过辅助素依赖的泛素 - 蛋白酶体途径实现对 AID 蛋白的靶向降解。简单来说，添加植物激素辅助素后，带有降解标签的 AID 蛋白就会被迅速降解，从而有效阻止基因转换。
在这项研究中，研究人员用到了多个关键技术方法。首先是构建细胞模型，通过基因编辑技术对 DT40 细胞进行改造，构建用于监测基因转换频率的细胞以及 AID2 细胞；其次是细胞培养与处理，对各类细胞进行培养，并在培养过程中添加或去除特定物质，如 TSA、辅助素等；然后利用酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选抗原特异性克隆；最后借助序列分析技术，对相关基因序列进行分析，探究基因变化情况。
下面来看看具体的研究结果。
- 开发监测基因转换频率的新方法：研究人员开发了一种利用荧光蛋白 mCherry 监测基因转换频率的新方法。传统的回复突变实验操作复杂、耗时久，而新方法通过将 mCherry 基因与鸡轻链（LC）基因的恒定区相连，并在可变区（V<sub>L</sub>）引入移码突变，使得基因转换修复移码突变时，细胞会同时表达表面免疫球蛋白 M（sIgM）和 mCherry，这样就能通过荧光轻松监测基因转换事件。经过一系列实验验证，他们成功构建了可用于监测基因转换频率的 mp232 细胞。
- 构建 AID2 细胞：按照特定流程，研究人员先敲除 mp232 细胞中的 AID 基因，再引入 TIR1 泛素连接酶表达载体和降解标签标记的 AID 表达载体，构建 AID2 细胞。实验发现，只有 C 末端标记降解标签的 AID 能够诱导基因转换。添加辅助素后，AID2 细胞中的 AID 蛋白会迅速降解，基因转换被有效抑制。而且，辅助素的添加还能抑制重链（HC）位点的免疫球蛋白重排。
- AID2 细胞在 ADLib 系统中的应用：研究人员将 AID2 细胞应用于 ADLib 系统。在构建文库时，发现不添加 TSA 培养 AID2 细胞也能制备文库。以兔免疫球蛋白 G（rIgG）、载铁蛋白（apoferritin）和人表皮生长因子受体（EGFR）为模型抗原进行筛选，成功获得了针对这些抗原的特异性 mAbs。对获得的克隆进行分析发现，其抗原特异性由基因转换和 / 或体细胞高频突变赋予，且 AID2 细胞为基础的 ADLib 系统性能与传统 ADLib 系统相当。
研究结论和讨论部分指出，本研究成功开发了监测基因转换频率的新方法，并构建了 AID2 细胞，将其应用于 ADLib 系统后，有效生成了针对多种抗原的高特异性 mAbs。与以往构建条件突变体的方法相比，AID2 系统能更迅速、彻底地抑制 Ig 基因转换，且不会损失文库多样性。不过，AID2 系统也并非十全十美，仍然有改进的空间，如辅助素诱导降解系统存在渗漏降解和需要高剂量辅助素的问题，且 AID2 细胞的构建过程较为繁琐。但随着相关技术的不断发展，这些问题有望得到解决。总的来说，AID2 细胞为生成和稳定抗原特异性克隆提供了强大的工具，对推动 mAbs 的生产和应用具有重要意义，为生物医学研究和临床治疗带来了新的希望和可能。
