CRISPRi-ART：解析噬菌体功能基因组的创新利器

为探究噬菌体基因功能，美国加州大学伯克利分校的研究人员开展 CRISPRi-ART 技术研究，发现该技术可用于多种噬菌体功能基因组分析，揭示超 90 个未知功能基因，为噬菌体研究提供新平台。

　　噬菌体，作为地球上数量最为庞大且遗传多样性极高的生物群体，它们与细菌宿主之间持续进行着一场激烈的 “军备竞赛”。这场看不见硝烟的战争不仅深刻影响着微生物的生态平衡，还与人类健康和整个生物圈的稳定息息相关。然而，尽管噬菌体在生态系统中扮演着如此重要的角色，科学家们对它们的了解却十分有限。在噬菌体的基因组中，大量基因的功能仍是未解之谜，这就好比在一座巨大的宝藏库中，大多数宝藏的价值和用途无人知晓。

目前，研究噬菌体基因功能的实验方法存在诸多局限。传统的功能基因组学工具在面对噬菌体时常常 “失灵”，因为噬菌体独特的生物学特性使得这些工具难以发挥作用。例如，一些基于 DNA 靶向的技术，在遇到某些特殊的噬菌体，如单链 RNA 噬菌体或形成细胞核的噬菌体时，就会陷入困境，无法准确地研究其基因功能。因此，开发一种通用且高效的实验方法，来深入探究噬菌体基因的功能，成为了科学界亟待解决的难题。

为了攻克这一难题，来自美国加州大学伯克利分校（University of California, Berkeley）等多个机构的研究人员展开了一项极具创新性的研究。他们将目光聚焦于一种名为 CRISPR 干扰通过反义 RNA 靶向（CRISPRi-ART）的技术，试图利用它来打开噬菌体基因功能研究的新大门。研究人员通过一系列实验，发现 CRISPRi-ART 技术展现出了强大的功能。相关研究成果为深入了解噬菌体的生物学特性奠定了坚实基础，也为噬菌体在生物工程、医学治疗等领域的应用开辟了新的道路，发表于《Nature Microbiology》期刊。

在这项研究中，研究人员运用了多种先进的技术方法。首先是 CRISPRi-ART 技术，利用 RNA 引导的 dCas13d 蛋白结合并阻断基因的核糖体结合位点（RBS），从而干扰蛋白质的表达，引发噬菌体的适应性变化。同时，他们构建了针对噬菌体的 CRISPRi-ART 文库，通过对多种噬菌体进行筛选，实现了转录组范围的基因功能研究。在实验过程中，还运用了高通量测序技术对筛选结果进行分析，精确地量化了噬菌体基因的适应性。此外，研究人员使用了噬菌斑分析等实验方法，来验证 CRISPRi-ART 技术对噬菌体感染的影响。

下面来看具体的研究结果。

1. 靶向 dCas13d 抑制蛋白表达：研究人员为了探究 dCas13d 介导的翻译抑制原理，构建了单核苷酸分辨率的 CRISPR RNA（crRNA）文库，并将其导入表达 dCas13d 的大肠杆菌中。通过竞争生长实验发现，当 crRNA 结合在目标必需基因起始密码子附近的核糖体结合位点（RBS）时（约 70 个核苷酸范围内），会导致大肠杆菌出现明显的生长缺陷，而靶向已知非必需基因的 RBS 区域则不会影响生长。这表明 dCas13d 靶向 RBS 区域能够有效抑制蛋白表达12。
2. CRISPRi-ART 干扰噬菌体感染：研究人员将噬菌体 T4 应用于表达诱导型 dCas13d 和组成型 crRNA 的大肠杆菌，以此评估 CRISPRi-ART 能否通过靶向 RBS 区分噬菌体基因的必需性。实验结果显示，靶向 T4 必需基因的 crRNA 能够使噬菌体的噬菌斑形成效率（EOP）降低 102 - 10?倍，而靶向非必需基因的 crRNA 则不会导致感染性丧失。与之前建立的双链 DNA 靶向的 CRISPRi 工具相比，CRISPRi-ART 展现出了更强的抗噬菌体活性。此外，研究还发现 CRISPRi-ART 能够避免极性效应，在准确判断基因必需性方面具有显著优势345。
3. CRISPRi-ART 对多种噬菌体有效：研究人员将 CRISPRi-ART 技术应用于 12 种不同类型的大肠杆菌噬菌体，涵盖了单链 RNA、单链 DNA、双链 DNA 等多种基因组类型，以及温和噬菌体、慢性噬菌体和裂解性噬菌体等不同生活方式。实验结果表明，针对每种噬菌体设计的至少一种 crRNA 能够显著降低 EOP 和噬菌斑大小。对于一些噬菌体，同时靶向两个必需基因的 crRNA 会产生协同效应，几乎完全消除噬菌斑的形成。此外，研究人员还对单链 RNA 噬菌体 MS2 进行了转录组范围的敲低筛选，进一步证明了该技术在不同噬菌体中的有效性。同时，CRISPRi-ART 在四种对噬菌体 PTXU04 敏感的大肠杆菌菌株中也取得了显著的效果，表明其可应用于多种野生型宿主67。
4. CRISPRi-ART 揭示超感染免疫抑制因子：研究人员利用 CRISPRi-ART 技术研究了广泛存在但功能未知的 rII 基因模块在破坏 lambda 溶原菌编码的 RexAB 超感染免疫中的作用。研究发现，敲低 T4、MM02、EdH4、SUSP1 和 N4 噬菌体中的 RIIA 或 RIIB 基因，会降低这些噬菌体在表达 Lambda RexAB 的大肠杆菌中的感染效率，但对缺乏 Rex 的大肠杆菌感染没有明显影响。这表明不同的 rII 系统能够抑制 Rex 介导的免疫，从而允许超感染的发生89。
5. 转录组规模的翻译抑制量化噬菌体基因适应性：研究人员针对噬菌体 T4 的每个基因，用七个跨越 RBS 区域的 crRNA 进行靶向，并通过一次混合实验评估了转录组范围的噬菌体基因适应性。实验结果与已知的 T4 噬菌体基因必需性高度一致，不仅捕获了许多已确立的必需基因，还发现了一些之前未知但对噬菌体感染很重要的基因。在噬菌体 T5、SUSP1 和 PTXU04 中进行的类似筛选，也揭示了许多具有未知功能但在噬菌体感染中起重要作用的基因。通过单 crRNA 噬菌斑实验和互补实验，进一步验证了这些基因的重要性1011。

在讨论部分，研究人员指出 CRISPRi-ART 技术为噬菌体功能基因组学研究提供了一个强大的平台。它不仅能够识别已知噬菌体中的重要基因，还揭示了许多在非模式噬菌体感染中具有重要作用的未知功能基因。这些发现有助于推动对噬菌体生物学的深入理解，加速可用于噬菌体工程的非必需基因组区域的识别。与野生型 Cas13 噬菌体基因编辑策略相结合，CRISPRi-ART 技术可指导噬菌体基因组的缩减，为噬菌体治疗或微生物组编辑等应用提供有力支持。然而，该技术也存在一些局限性，例如其引导设计依赖于噬菌体基因组中起始密码子的正确预测，部分引导可能仅产生温和的表型等。但随着技术的不断改进和优化，CRISPRi-ART 有望在噬菌体研究领域发挥更大的作用，为解决与噬菌体相关的各种问题提供更多的可能性。