基于 E3 泛素连接酶构建膀胱癌分子亚型与预后模型，助力精准诊疗

为解决膀胱癌（BLCA）预后评估及治疗困境，南京医科大学第二附属医院研究人员开展基于 E3 泛素连接酶的研究，构建分子亚型和预后模型，为精准诊疗提供依据。

　　在全球范围内，膀胱癌（Bladder Cancer，BLCA）是一个不容忽视的健康难题，它是全球第十大常见恶性肿瘤，也是泌尿系统第二大癌症。每年超 55 万新发病例和 20 万死亡病例，像阴霾一般笼罩在人们心头。BLCA 分为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC），大部分患者初诊时为 NMIBC，但 MIBC 更为凶险。即便采用激进治疗手段，许多患者术后仍面临肿瘤复发和转移风险，转移性 BLCA 患者预后更是极差，中位总生存期仅 12 - 14 个月。这主要归咎于癌细胞的侵袭性、高增殖性以及恶性细胞的异质性，因此，探寻 BLCA 的分子机制，寻找新型生物标志物迫在眉睫。

蛋白质的翻译后修饰在细胞生物学过程中起着精细调控的作用，而泛素化修饰是其中极为重要的一环。泛素化过程由泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）协同完成，其中 E3 泛素连接酶赋予了整个系统特异性，负责识别、结合并招募特定底物进行修饰。大量研究表明，E3 泛素连接酶在癌症进展中扮演关键角色，但在 BLCA 中，其预后意义和免疫学影响却鲜为人知，在治疗结果和患者免疫治疗反应方面的研究也有待深入。

为了攻克这些难题，南京医科大学第二附属医院等机构的研究人员开展了一项系统性研究。研究成果为 BLCA 的精准诊疗提供了新方向，具有重要的临床意义。

研究人员开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先，从癌症基因组图谱（TCGA）数据库获取 BLCA 的转录组数据和临床信息，同时从基因表达综合数据库（GEO）获取相关数据作为补充，筛选出 835 个 E3 连接酶基因数据用于后续分析。通过 “ConsensusClusterPlus” R 包对 E3 相关基因进行一致性聚类分析，利用 “DESeq2” 软件包进行差异基因表达分析。此外，借助单变量 Cox 回归、多变量 Cox 回归和最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归分析构建预后模型。还运用 ESTIMATE 算法评估免疫评分等指标，采用 TIMER2.0 算法预测免疫细胞浸润，使用 TIDE 算法预测免疫治疗反应，通过计算 IC₅₀值评估药物敏感性。在细胞实验方面，进行了细胞培养、转染、RNA 提取、定量实时荧光定量 PCR（qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）等实验。

下面来详细看看研究结果。

1. 基于 E3 连接酶的 BLCA 分子亚型鉴定：研究人员对 TCGA 队列中 BLCA 患者的 E3 连接酶表达矩阵进行无监督一致性聚类分析，发现了两个与 E3 连接酶相关的簇（EC1 和 EC2）。主成分分析（PCA）显示这两个簇在转录水平上差异显著。进一步分析发现，EC2 簇中晚期和老年患者比例更高，而且 EC2 患者的总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展生存期（PFS）均比 EC1 患者差。这表明基于 E3 连接酶可变表达的两个分子亚型具有不同的临床特征和预后。
2. 不同分子亚型的功能状态特征：通过差异表达基因（DEG）分析和基因集富集分析（GSEA），发现 EC1 簇患者在缺氧、凋亡和 mTORC1 信号通路等方面富集分数较高；EC2 簇患者在上皮 - 间质转化（EMT）、干扰素（IFN）反应和 TNFα 通过 NF - κB 信号通路等方面富集分数较高。KEGG 和基因本体（GO）功能富集分析表明，EC2 簇患者多个免疫相关信号通路增强，而 EC1 簇患者在一些代谢途径上富集。此外，利用基因集变异分析（GSVA）算法发现，EC2 亚型患者中星形胶质细胞样、基底和干扰素模块等基因模块富集，EC1 簇患者在纤毛和氧化磷酸化（oxphos）模块得分更高。这揭示了两个分子亚型在功能状态上的差异，为理解 BLCA 进展机制提供了新视角。
3. E3 连接酶分子亚型揭示不同的免疫景观：运用 GSVA 算法分析免疫相关特征，发现除 II 型 IFN 反应外，EC2 簇中大部分免疫相关通路富集水平更高。ESTIMATE 算法检测发现 EC2 簇的肿瘤微环境（TME）得分更高。CIBERSORT 分析显示，EC2 簇中 M2 样巨噬细胞、浆细胞和活化的 NK 细胞浸润水平较高，EC1 簇中 T 滤泡辅助（Tfh）细胞更丰富。但 EC2 簇患者免疫治疗效果较差，这可能与该簇中免疫检查点（如 PDCD1、CTLA4、CD274 和 TIGIT）高表达导致免疫抑制性 TME 有关。这全面展示了两个 EC 分子亚型在 BLCA 中的免疫景观和免疫治疗疗效差异。
4. BLCA 中 E3 连接酶相关预后特征的建立：研究人员从 EC1 和 EC2 簇的差异表达基因中筛选出 7 个基因（EMP1、CLSTN2、SERPINB2、PTGER3、SULT1C2、XDH 和 SLC26A8），构建了风险评估模型。在 TCGA 队列训练集中，高风险组患者生存率低于低风险组，1 年、3 年和 5 年的受试者工作特征曲线（ROC）下面积（AUC）分别为 0.68、0.72 和 0.76。在 GSE32548 和 GSE32894 队列验证集中，高风险组患者同样预后较差，且风险评分与患者年龄和疾病分期相关，表明该模型可有效预测 BLCA 预后。
5. 预测 BLCA 生存的列线图开发：单变量和多变量 Cox 回归分析表明，E3 连接酶相关预后特征评分是 BLCA 患者的独立预后因素。研究人员据此开发了预测列线图，校准曲线和决策曲线分析（DCA）显示该列线图具有较高的预测准确性和临床价值，能为临床医生预测患者生存提供有力工具。
6. 高 / 低风险组患者的功能和基因组特征：对高风险和低风险患者进行 DEG 分析，GO 和 KEGG 富集分析显示，低风险组上调基因与多种代谢途径相关，高风险组上调基因与 PI3K - AKT 信号通路等相关。GSEA 分析发现，高风险患者中 IFNγ 反应、P53 通路和凋亡相关通路升高，低风险患者中 EMT、炎症反应和血管生成高度富集。此外，高风险组 KDM6A 和 FGFR3 突变频率较高，RB1 突变频率较低，低风险组肿瘤突变负荷（TMB）略高。这些结果揭示了高风险和低风险 BLCA 患者在功能和基因组特征上的差异。
7. 两个风险组中不同的免疫微环境和免疫治疗反应：ESTIMATE 分析显示，高风险患者 TME 评分更高，且与风险评分正相关。CIBERSORT 分析表明，高风险组 M2 样巨噬细胞、M1 样巨噬细胞和活化记忆 CD4⁺T 细胞丰度较高，CD8⁺T 细胞、Tfh 细胞和活化髓样树突状细胞丰度较低，且风险评分与多个免疫检查点正相关。TIDE 分析预测，低风险组患者对免疫治疗的反应更好，在黑色素瘤患者接受 nivolumab 治疗的数据集分析中也得到了类似结果，表明低风险患者可能从免疫治疗中获得更大益处。
8. 不同风险组之间抗癌药物敏感性的差异：计算训练集样本中各药物的 IC₅₀值，发现风险评分与 TAF1_5496、KRAS 抑制剂和奥沙利铂的 IC₅₀值正相关，与 NU7441 和 KU.55,933 的 IC₅₀值负相关。低风险组对奥沙利铂、大象素和达泊西汀更敏感，高风险组对星形孢菌素、luminespib 和达沙替尼更敏感。在细胞实验中，敲低 T24 和 5637 细胞系中的 EMP1 基因，显著增强了奥沙利铂的抗肿瘤作用，为 BLCA 临床治疗提供了重要参考。
9. 抑制 SLC26A8 促进 BLCA 肿瘤进展：研究聚焦于 SLC26A8 这一在 BLCA 中研究较少的保护性预后基因。通过 siRNA 沉默 T24 和 5637 细胞系中 SLC26A8 的表达，实验结果显示，SLC26A8 敲低显著促进了 BLCA 细胞的增殖、侵袭和迁移，抑制了细胞凋亡，表明抑制 SLC26A8 可有效促进 BLCA 肿瘤进展。

综合上述研究，研究人员首次将 BLCA 患者分为两个独特的 EC 簇，它们在生存结局、免疫细胞浸润等方面存在显著差异。同时，引入 E3 连接酶相关预后特征作为预测 BLCA 患者预后的新型独立预后因素。基于 E3 连接酶的分子分型和预后特征可作为肿瘤进展的有力指标，为指导 BLCA 的个性化临床决策，尤其是免疫治疗提供了极具潜力的工具。不过，该研究也存在一定局限性，如临床应用可能面临困难，回顾性招募患者可能存在偏差，未来还需通过多中心随机对照试验进一步验证。但总体而言，这项研究为膀胱癌的诊疗开辟了新的方向，有望在未来显著改善膀胱癌患者的治疗效果和预后。