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为解决肿瘤耐药问题，安达卢西亚分子生物学与再生医学中心（Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa - CABIMER）的研究人员开展了关于乳腺癌放疗耐药机制的研究。结果发现 AEP/ATR/PPP1R10 轴在乳腺癌放疗耐药中起关键作用，为乳腺癌治疗提供了新靶点和预测生物标志物。
肿瘤耐药一直是癌症治疗领域的 “硬骨头”，严重阻碍着癌症患者的康复进程。在当今的肿瘤治疗中，尽管化疗和放疗技术不断进步，为众多癌症患者带来了希望，可肿瘤耐药现象依旧普遍存在。据统计，80 - 90% 的癌症患者死亡都与肿瘤耐药相关，这一复杂现象涉及细胞的诸多变化，像是 DNA 修复能力增强、细胞凋亡诱导缺陷以及自噬异常等。因此，探寻参与肿瘤耐药的关键分子并将其作为潜在药物靶点，从而使癌细胞对现有治疗更敏感，成为了攻克癌症的关键方向。
在众多与肿瘤相关的分子中，天冬酰胺内肽酶（Asparagine endopeptidase，AEP）引起了研究人员的关注。已有研究表明，AEP 在多种人类实体瘤中过度表达，并且与患者预后不良、总生存率降低密切相关。然而，AEP 影响癌症患者生存的具体机制却一直是个未解之谜。为了深入了解其中的奥秘，安达卢西亚分子生物学与再生医学中心（Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa - CABIMER）等机构的研究人员展开了一项关于乳腺癌放疗耐药机制的研究。
研究人员通过一系列实验，取得了令人瞩目的成果。他们发现 AEP 在乳腺癌患者对基因毒性应激（genotoxic stress）的抵抗中起着双重作用，这一作用与 AEP 对丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 ATR（ATR）和丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶 1 调节亚基 10（PPP1R10）水平的调节密切相关。具体来说，AEP 能够抑制 ATR 水平，减少 DNA 损伤诱导的细胞死亡；同时，AEP 还能降低 PPP1R10 水平，促进 Chek1/P53 细胞周期检查点激活，帮助乳腺癌细胞更有效地修复 DNA。此外，研究还表明，AEP 缺陷会导致癌细胞基因组不稳定、DNA 损伤信号增加、Chek1/P53 激活受损、DNA 修复能力下降以及细胞死亡。更为重要的是，研究人员发现 AEP 高表达 / ATR 低表达的患者总生存率明显降低，且对放疗反应不佳。这意味着，AEP/ATR/PPP1R10 轴有望成为预测乳腺癌患者放疗反应的生物标志物，同时 AEP 也可作为提高乳腺癌放疗和化疗敏感性的潜在治疗靶点。这一研究成果为乳腺癌的治疗开辟了新的方向，为攻克肿瘤耐药难题带来了新的希望。
在本次研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们借助高通量蛋白质组学技术，全面分析了 AEP 抑制后的蛋白变化情况，从而筛选出潜在的 AEP 靶点；利用细胞和分子生物学方法，如免疫印迹（immunoblotting）、定量聚合酶链反应（qPCR）等，对蛋白和 mRNA 水平进行量化分析；通过流式细胞术（flow cytometry）、共聚焦显微镜（confocal microscopy）等技术，深入研究细胞的功能和分子定位；还运用了 DNA 修复实验，评估细胞的 DNA 修复能力。此外，研究人员使用了来自癌症基因组图谱（TCGA）的乳腺癌数据集进行计算机分析，并通过对独立的浸润性导管癌（IDBC）患者队列进行免疫荧光检测，进一步验证了研究结果的临床相关性。
下面详细介绍一下具体的研究结果：
- AEP 对癌细胞增殖和细胞周期的影响：研究人员利用 GEPIA2 在线工具和 TCGA 数据库进行分析，发现 AEP 在多种人类实体瘤中高表达，且与患者预后不良和总生存率降低相关。在三阴性乳腺癌中，高 AEP 表达与患者总生存率大幅下降密切相关。通过使用特异性抑制剂 MVO26630 抑制 AEP 活性，以及利用 shRNA 介导的 AEP 敲低实验，研究人员发现 AEP 抑制会显著降低癌细胞增殖，导致细胞死亡增加和 G2/M 期细胞比例上升，同时还会引发基因组不稳定，如出现含微核细胞和多核细胞增多、核内 DNA 桥形成等现象，这表明 AEP 在维持癌细胞染色体稳定性和 DNA 损伤修复中具有重要作用。
- AEP 的非经典功能及潜在靶点的发现：研究人员在筛选不同细胞系后，发现 HEK293 细胞具有较高的 AEP 活性，适合用于研究 AEP 的潜在靶点。通过对未处理和 MVO26630 处理的 HEK293 细胞进行无标记定量高分辨率质谱分析，研究人员鉴定出 3766 种蛋白质，其中 283 种在 AEP 抑制后显著积累。基因本体（GO）分析显示，这些潜在 AEP 靶点中 45.4% 定位于细胞核，且许多与 DNA 损伤反应、细胞周期调控和有丝分裂 / 染色体分离相关。此外，研究人员还鉴定出了一些新的 AEP 切割位点，进一步证实了 AEP 在调节关键核蛋白水平方面的作用。
- AEP 与 ATR 的关系及对乳腺癌患者生存的影响：研究人员通过共聚焦显微镜和亚细胞分级分析，证实了 AEP 在乳腺癌细胞中的核定位。相关性分析表明，AEP 蛋白水平与一些参与 DNA 损伤信号和细胞周期的蛋白呈负相关，且 AEP 与 ATR 在蛋白水平上存在直接关联，AEP 可直接调节 ATR 水平。生存分析显示，高 AEP 表达和低 ATR 表达的乳腺癌患者预后较差，总生存率降低。在其他类型癌症中，也观察到了类似的 AEP/ATR 表达与预后的关系，这表明 AEP/ATR 轴在癌症中具有更普遍的作用。
- AEP 对乳腺癌细胞基因毒性应激抵抗的机制：研究发现，AEP 缺陷的癌细胞中，尽管 ATR 水平升高，但 Chek1 和 P53 的磷酸化水平却降低，且磷酸化速率加快。这导致细胞周期检查点激活受损，DNA 修复能力下降，基因组不稳定，最终导致细胞死亡。通过使用 DNA 修复报告基因实验，研究人员证实 AEP 缺陷会显著降低同源重组修复效率。此外，研究还发现 AEP 通过调节 PPP1R10 水平来调控蛋白磷酸酶活性，进而影响 Chek1 和 P53 的磷酸化水平。AEP 与 PPP1R10 在蛋白水平呈负相关，AEP 可直接与 PPP1R10 相互作用并调节其水平，这为解释 AEP 在乳腺癌细胞基因毒性应激抵抗中的作用提供了重要的分子机制。
- AEP - ATR 轴对乳腺癌患者放疗反应的影响：研究人员通过对 TCGA 乳腺癌患者数据的分析，发现 AEP 高表达 / ATR 低表达的患者总生存率明显低于 AEP 低表达 / ATR 高表达的患者。进一步研究表明，AEP 高表达 / ATR 低表达的患者对放疗反应不佳，而 AEP 抑制可使乳腺癌细胞对化疗药物顺铂和依托泊苷更敏感。通过对 IDBC 患者样本的免疫组化和免疫荧光分析，研究人员发现非应答患者的癌细胞中 AEP 水平更高，且 AEP 与 ATR 水平呈负相关，这进一步证实了 AEP/ATR 轴在预测乳腺癌患者放疗反应中的重要作用。
研究结论和讨论部分再次强调了本次研究的重要意义。研究揭示了 AEP 在乳腺癌放疗耐药中的关键作用，AEP/ATR/PPP1R10 轴不仅是乳腺癌放疗耐药的关键决定因素，还可作为预测放疗反应的生物标志物和潜在治疗靶点。这一发现为理解肿瘤耐药机制提供了新的视角，为开发针对放疗耐药乳腺癌患者的新型治疗策略奠定了理论基础。同时，研究还发现 AEP 与 ATR 在其他类型癌症中也存在类似的关系，这暗示了 AEP/ATR 轴在癌症中的普遍作用，尽管其在其他癌症中的具体机制仍有待进一步探索。总之，本次研究成果为癌症治疗领域带来了新的曙光，有望推动乳腺癌治疗取得新的突破。
