通过半理性工程提高庆大霉素双脱氧生物合成中 GenB3 和 GenB4 的活性，助力新型 AGs 类似物合成

为解决半合成氨基糖苷类抗生素（AGs）化学合成存在的问题，沈阳药科大学的研究人员开展 GenB3 和 GenB4 的半理性工程研究，提高了其活性，为新型 AGs 类似物合成奠定基础。

　　氨基糖苷类抗生素（Aminoglycoside antibiotics，AGs）在临床抗菌领域一直占据着举足轻重的地位。自链霉素用于治疗结核病以来，人们陆续发现了卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素和西索米星等多种 AGs。然而，这些 AGs 在临床应用中逐渐暴露出严重的耳毒性、肾毒性副作用以及耐药性问题。为此，科研人员开发了一系列半合成 AGs，如奈替米星、阿贝卡星和普拉佐米星 ，主要对 C'-NH?和 C1-NH?进行修饰来改善性能。

除了抗菌，AGs 在其他领域也展现出独特潜力。庆大霉素可通过激活 P53 诱导肿瘤细胞凋亡，还能抑制 miR-34a 治疗缺血性中风；西索米星和卡那霉素的类似物可作为 RNA 重复序列结合剂治疗强直性肌营养不良，它们还能充当非离子、可生物降解的递送载体，增强反义寡核苷酸的递送效率。这些新发现让合成结构多样的 AGs 变得愈发重要。

但 AGs 化学合成困难重重，化学合成中的选择性问题突出，且保护和脱保护步骤繁琐，导致合成路线冗长、产率低下。例如，以西索米星为前体合成各种 AGs 时，步骤多且产率低，合成庆大霉素 B1 和庆大霉素 X2 需 6 步，产率仅 10%-14%；合成 Verdamicin C2 和 Verdamicin C2a 需 7 步，产率低于 3% 。因此，酶法合成受到广泛关注，它能够更绿色、高效地引入活性基团，为新型 AGs 类似物的合成开辟新途径。

在庆大霉素的生物合成过程中，双脱氧反应是重要环节，涉及的关键前体与半合成 AGs 密切相关。GenP、GenB3 和 GenB4 在其中发挥着关键作用，GenP 使 JI-20 A 和 JI-20Ba 磷酸化，GenB3 去除磷酸基团形成西索米星和 Verdamicin，GenB4 迁移双键生成 C1a 和 C2a 。不过，此前对 GenB3 和 GenB4 的研究多集中在基因功能方面，对蛋白质工程的研究较少。

为了深入挖掘 GenB3 和 GenB4 的潜力，沈阳药科大学的研究人员开展了一项极具价值的研究。研究人员首先对 GenB3 和 GenB4 的催化特性展开研究，利用它们成功合成了西索米星、Oxo-verdamicin、Oxo-gentamicin C1a 和 Oxo-gentamicin C2a 。在此基础上，基于 GenB3（PDB ID: 7LM0）和 GenB4（PDB ID: 7LLD）的晶体结构，运用半理性工程策略对这两种酶进行改造，以提高其活性。研究人员构建了以棘孢小单孢菌（M. echinospora）为宿主的工程菌株，使其能够产生单一组分的西索米星、Oxo-Ver、C1a 和 C2a，并在这些菌株中验证了 GenB3 和 GenB4 突变体的有益效果，借助分子动力学模拟揭示了突变体活性增强的机制。该研究成果为新型庆大霉素类似物的合成奠定了基础，也为在棘孢小单孢菌中构建细胞工厂、合成更多有价值的 AGs 单一组分提供了参考。

在这项研究中，研究人员使用了多种关键技术方法。通过定点突变技术，对 GenB3 和 GenB4 的关键氨基酸残基进行突变，以获得有益突变体；利用分子动力学模拟，深入探究突变对酶结构和活性的影响；构建工程菌株，在体内验证突变体的效果；运用 HPLC-ELSD 分析技术，对反应产物进行检测和分析。

研究结果主要包含以下几方面：

1. 底物与酶的亲和力：研究发现，C6’- 甲基化底物与 GenB3 和 GenB4 的亲和力较低，导致反应效率下降。GenB3 和 GenB4 对不含 C6’甲基的底物（如 JI-20 A-P 和西索米星）催化效率较高，而对含 C6’甲基的底物（如 JI-20Ba-P、JI-20B-P 和 Verdamicin C2a）催化效率较低，且 GenB3 具有立体选择性，不识别 C'-CH?(R) 底物。
2. GenB3 关键氨基酸残基的鉴定：通过对 GenB3 与底物结合口袋的分析，确定了多个关键氨基酸残基。在此基础上进行定点突变和组合突变，筛选出了活性显著提高的突变体。如 GenB3M1（Q270N）对 JI-20A-P 的活性比 GenB3WT 高 1.74 倍；GenB3M2（L361C/A412T/Q270N）对 JI-20Ba-P 的活性比 GenB3WT 高 1.34 倍 15。
3. GenB4 的有益突变体：参考 GenB3 的突变，在 GenB4 的平行位置引入突变。结果显示，GenB4M1（L356C）对西索米星的活性比 GenB4WT 高 1.51 倍；GenB4M2（L356C/A407T/Q265N）对 Verdamicin C2a 的活性比 GenB4WT 高 1.34 倍 15。
4. 突变体在工程菌株中的作用：构建了能产生单一产物的工程菌株，在这些菌株中过表达突变体。结果表明，GenB3M1 可使工程菌株中 JI-20A-P 更多地转化为西索米星，产量提高 39.91%；GenB4M1 能促进西索米星更多地转化为 C1a，产量增加 26.74% 。GenB3M2 可使 Oxo-Ver 产量增加 20.01%，增强代谢通量；GenB4M2 使 ZL101 产量大幅提升 97.36% 23。
5. 分子动力学模拟：通过分子动力学模拟发现，GenB3M1 活性增强主要是因为在活性中心形成了氢键网络；GenB4M1 活性提高是由于 K238 与反应中心的距离缩短。此外，GenB3M2 对 JI-20Ba-P 表现出协同效应，而对 JI-20A-P 无此效应 455。

研究结论和讨论部分表明，该研究成功合成了多种化合物，为更多 AGs 类似物的化学酶法合成奠定了基础。通过半理性工程策略提高了 GenB3 和 GenB4 的活性，并在工程菌株中验证了突变体的效果。分子动力学模拟揭示了突变体活性增强的机制，为后续研究提供了理论依据。这一研究成果不仅为新型庆大霉素类似物的合成提供了新方法，也为在棘孢小单孢菌中构建细胞工厂、高效合成更多有价值的 AGs 单一组分提供了重要参考，有望推动氨基糖苷类抗生素在临床治疗和其他领域的进一步应用和发展。