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为探究蓝莓抗病机制，安徽合肥师范学院研究人员对蓝莓 VcRBOH 基因开展研究，发现其在植物防御响应中起重要作用，为蓝莓抗病研究提供新方向。
在植物的微观世界里，它们时刻面临着各种病原体的威胁，就像人类会生病一样，植物也会遭受病害的侵袭。蓝莓，作为一种深受人们喜爱的高营养水果，在种植过程中同样受到病害的困扰，这严重影响了蓝莓的产量和品质。一直以来，植物为了抵御病原体的侵害，进化出了复杂的防御机制，其中活性氧（ROS）作为信号分子在植物防御响应中起着关键作用，而呼吸爆发氧化酶同源蛋白（RBOH）则是产生 ROS 的关键酶。尽管在许多植物中已经发现了大量 RBOH 家族成员，但蓝莓中的 RBOH 基因却鲜为人知。为了深入了解蓝莓的抗病机制，来自安徽合肥师范学院的研究人员开展了关于蓝莓 VcRBOH 基因的研究，该研究成果为蓝莓抗病研究开辟了新的道路。
研究人员在此次研究中，运用了多种技术方法。他们从 NCBI 数据库下载拟南芥和水稻的 RBOH 蛋白序列，通过与蓝莓基因组数据库比对，结合隐马尔可夫模型（HMM）搜索和 CD-search 工具，鉴定出蓝莓中的 VcRBOH 蛋白序列。利用 Expasy 网站和 WOLFSORT 软件对蛋白的理化性质和亚细胞定位进行分析，通过 Mega11 软件构建系统发育树，借助多种在线工具和软件分析基因结构、保守结构域、基序以及顺式作用元件。同时，基于转录组测序数据和实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）技术研究基因表达模式，还运用转基因技术将 VcRBOHF 基因导入拟南芥，探究其在植物防御中的功能。
下面来看看具体的研究结果。首先是基因组范围内对蓝莓 VcRBOH 基因的鉴定，研究人员共识别出 6 个蓝莓 VcRBOH 基因，并将其命名为 VcRBOHA 至 VcRBOHF。这些基因均匀分布在蓝莓的 7 个染色体支架上，预测的氨基酸长度差异较大，蛋白的分子量、理论等电点和不稳定指数也各有特点，且所有 VcRBOH 蛋白均被预测定位于质膜上。
接着是系统发育和进化分析，通过 Mega11 软件构建的系统发育树显示，VcRBOH 蛋白可分为三个进化分支，每个分支都包含来自蓝莓、拟南芥、番茄和水稻的 RBOH 成员。除 VcRBOHF 与拟南芥 AtRBOHF 遗传关系较近外，其他 VcRBOH 蛋白与番茄的 SlRBOH 成员遗传关系更近，这表明蓝莓的 RBOH 蛋白在进化关系上与番茄更为密切。
在结构分析方面，研究发现 VcRBOH 成员包含多个保守结构域，如 NADPH_Ox、Ferric_reduct、FAD_binding_8、NAD_binding_6 和 EF 手结合结构域，且这些结构域在不同植物中相似，部分蛋白还存在结构域重复现象。通过 MEME 分析发现 15 个保守基序，除个别蛋白缺失特定基序外，其他蛋白基序排列一致，体现了蛋白序列的高度保守性。基因结构分析显示，成员的编码序列（CDS）和非翻译区（UTR）在数量和长度上存在差异，同一进化枝的基因外显子和内含子分布相似。
对于顺式作用元件的分析，研究人员发现 VcRBOH 基因启动子区域包含与胁迫响应、光响应和植物激素响应相关的顺式作用元件，这意味着这些基因可能参与多种生物过程，并且可能受到脱落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等植物激素的调控。
组织特异性分析表明，不同的 VcRBOH 基因在蓝莓不同组织和发育阶段的表达模式各异。VcRBOHB、VcRBOHC 和 VcRBOHE 在花期表达量较低，在其他组织几乎不表达；VcRBOHA 和 VcRBOHD 在多种组织中均有检测到，在花芽和新梢中表达量较高；VcRBOHF 在花芽、绿果、落花和新梢中表达量较低。这说明同一进化分支或具有同源性的基因在组织表达模式上具有相似性，且 VcRBOHA 和 VcRBOHD 可能在蓝莓发育调控中发挥重要作用。
在对病原体相关分子模式（PAMPs）的响应研究中，RT-qPCR 结果显示，不同的 VcRBOH 基因对 flg22 和几丁质处理的表达模式不同，其中 VcRBOHF 在处理后迅速且显著上调，表明它可能在模式触发免疫（PTI）中发挥重要作用。
进一步研究发现，过表达 VcRBOHF 能够促进拟南芥的 PTI 反应。将 FRK1 启动子荧光素酶报告基因载体和 VcRBOHF 过表达载体转入拟南芥原生质体后，检测发现荧光素酶活性显著增加。在转基因拟南芥中，flg22 诱导的 ROS 积累水平和胼胝质沉积均高于野生型，这表明 VcRBOHF 能够促进拟南芥的 PTI 反应。
最后，关于抗病性研究，接种致病细菌病原体 Pst DC3000 后，过表达 VcRBOHF 的拟南芥植株与野生型相比，症状更轻，细菌滴度更低，这说明过表达 VcRBOHF 能够增强拟南芥的抗病性。
综合研究结论和讨论部分，此次研究从蓝莓基因组中成功鉴定出 6 个 VcRBOH 基因，通过多方面分析发现它们在蛋白序列和功能上具有较高相似性，并且可能参与多种生物过程。其中，VcRBOHF 在植物防御中表现突出，对 flg22 和几丁质处理响应迅速，过表达它能够促进拟南芥的 PTI 反应并增强抗病性。这一研究为深入了解蓝莓的抗病机制提供了重要线索，为后续蓝莓抗病品种的培育奠定了理论基础，有助于提高蓝莓的产量和品质，在农业生产领域具有重要的应用价值。
