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本文通过全基因组测序（WGS）分析 1988 - 2022 年突尼斯南部分离的 24 株羊布鲁氏菌（B. melitensis）。研究其克隆关系、国际序列相关性、耐药性和毒力因子，发现菌株遗传稳定性高，为布鲁氏菌病防控提供重要依据，对公共卫生意义重大。
引言
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属细菌引起的人畜共患病，在全球范围内对公共卫生构成重大挑战。B. melitensis是导致人类感染的主要病原体。在许多国家，尽管努力根除，但布鲁氏菌病仍在一些地区流行，如地中海国家、巴尔干国家、中东、部分非洲地区以及亚洲和拉丁美洲的部分区域。
在突尼斯，布鲁氏菌病在人和牲畜中均为地方病，且发病率呈上升趋势，其中 80% 以上的人类病例来自南部地区。传统的生物分型和分子方法在B. melitensis的分型和监测中存在局限性，而全基因组测序（WGS）为深入分析该病原体提供了更有效的手段。此前，虽有全球多地对B. melitensis进行 WGS 研究，但在马格里布地区，尤其是突尼斯，尚无相关研究报道。本研究旨在利用 WGS 评估突尼斯南部B. melitensis菌株的基因组特征。
结果
一般基因组特征
对 24 株布鲁氏菌序列的基因组分析证实其为B. melitensis。测序数据显示，平均读长为 307,766（最小值 183,708，最大值 440,079）。基因组组装后，平均基因组大小为 3,286,965 bp（最小值 3,285,073 bp，最大值 3,293,649 bp），N50 平均值为 170,579 bp。所有序列的总重叠群序列长度覆盖了参考B. melitensis 16M 基因组的 99% 以上。注释工具分析表明，蛋白质编码基因数量在 3,131 到 3,148 之间。所有分离株均有 3 个 rRNA 拷贝，tRNA 拷贝数在 47 到 51 之间。泛基因组分析显示，共有 3,304 个基因，其中 3,054 个为核心基因，41 个为软核心基因，73 个为壳基因，136 个为云基因。
MLST - 9 分析将所有突尼斯B. melitensis分离株归为单一序列型 ST11。MLST - 21 方案鉴定出两种不同的 ST 谱：ST89（n = 18）和 ST114（n = 6），二者仅在dllA 位点存在差异。基于 1,764 个核心基因的 cgMLST 分析表明，所有菌株中检测到 1,645 个位点，其中 1,497 个相同，共鉴定出 4 种 cgST 谱。
24 株突尼斯分离株的系统发育分析
与参考序列进行 SNP 分析，共鉴定出 3,247 个核心基因组 SNP（cgSNP）位点，其中 2,028 个位于染色体 1，1,219 个位于染色体 2。24 个布鲁氏菌基因组与参考序列（B.melitensis 16M）相比，SNP 差异在 2,944 到 3,036 之间。突尼斯分离株之间的核心基因组 SNP 成对比较显示，SNP 差异在 0 到 143 之间。系统发育树显示，23 株分离株聚为一个簇，成对 cgSNP 差异在 0 到 77 之间，剩余的单个分离株（BR4）与其他菌株的成对 SNP 差异在 107 到 143 之间。
与国际序列的比较
国际最大似然系统发育分析确定了 6,971 个核心基因组 SNP 位点。比较分析揭示了B. melitensis系统发育的不同拓扑结构，分为四个主要谱系：美洲、非洲、东地中海和西地中海（WM）。突尼斯菌株属于 WM 谱系，在 WM 谱系内，成对 SNP 差异在 0 到 504 之间。WM 谱系与美洲谱系的 SNP 差异为 1,607 到 1,950，与非洲谱系的差异为 1,643 到 1,925，与东地中海谱系的差异为 1,534 到 1,856。
在 WM 谱系中，分离株分为两个亚群（A 和 B）。亚群 A 包含来自法国、意大利、瑞典和美国的基因组，成对 SNP 差异在 0 到 491 之间。亚群 B 包含突尼斯菌株以及来自摩洛哥、阿尔及利亚、埃及、厄立特里亚、意大利和美国的基因组，成对 SNP 差异在 0 到 179 之间。亚群 A 和 B 之间的成对 SNP 差异在 247 到 504 之间。在亚群 B 内，来自突尼斯、摩洛哥、阿尔及利亚、埃及、厄立特里亚、意大利和美国的菌株具有相同的 MLST - 21 序列类型（ST89 和 ST114）。
突尼斯菌株中，除 BR4 外，其余 23 株与其他公开的突尼斯人源菌株遗传相似性高，与阿尔及利亚菌株的成对 SNP 差异为 7 到 19，与摩洛哥菌株的差异为 15 到 27。突尼斯菌株与厄立特里亚的人源菌株也具有较高的遗传相似性，SNP 差异在 4 到 16 之间。与意大利的人源和动物源菌株、埃及的人源菌株以及美国的一株动物源菌株相比，遗传相关性略低。而突尼斯的单个分离株 BR4 与马格里布地区和厄立特里亚的菌株相比，遗传距离更远。
抗菌耐药性决定因素和毒力因子
通过多个数据库分析抗菌耐药性（AMR）决定因素，发现 24 株突尼斯B. melitensis序列中未鉴定出经典耐药基因，但存在多个肽因子（Brucella_suis_mprF）蛋白和外排相关基因bepC、bepD、pebE、bepF 和bepG。在抗生素耐药相关基因rpoB、folA、folP、gyrA、gyrB、parC、parE 中，未检测到先前描述的与耐药相关的 SNP，但发现了其他 SNP。
共鉴定出 67 个毒力基因，主要参与布鲁氏菌 IV 型分泌系统的调控和表达以及免疫调节，其中 32 个与脂多糖（LPS）的合成、成熟和功能相关。与国际序列比较表明，这些基因在 98% 以上的菌株中一致存在，仅virB10（88%）和 BPE043（94%）存在差异，但在所有谱系中分布无差异。
讨论
布鲁氏菌病在许多国家流行，对人畜健康造成严重负担。在突尼斯，B. melitensis是布鲁氏菌病的主要病原体。本研究利用 WGS 分析突尼斯B. melitensis分离株，对了解该病原体的流行病学和传播途径具有重要意义。
所有研究分离株均为B. melitensis，MLST - 9 分型显示均属于 ST11，MLST - 21 和 cgMLST 分析表明，突尼斯B. melitensis在三十多年间遗传稳定性高。国际系统发育分析表明，突尼斯菌株属于 WM 谱系，与摩洛哥、阿尔及利亚、埃及和意大利的菌株遗传关系密切，这可能与地中海地区的历史贸易和人员流动有关。但由于缺乏动物序列数据，研究存在一定局限性。
WGS 分析显示，突尼斯菌株未发现经典抗菌遗传决定因素，但存在Brucella suis - mprF 和bepCDEFG 基因，其在B. melitensis中的作用尚不清楚。此前研究表明，布鲁氏菌对多种抗生素敏感，但部分地区出现了对某些抗生素的耐药现象，如中国分离株对阿奇霉素耐药，埃及、伊朗和卡塔尔等地分离株对利福平可能耐药。
在毒力方面，B. melitensis的 67 个毒力基因主要参与 LPS 和 IV 型分泌系统（T4SS）的相关过程。LPS 有助于细菌逃避宿主免疫识别，T4SS 则调节宿主免疫反应并帮助细菌在细胞内存活。这些毒力因子在国际菌株中普遍存在，表明布鲁氏菌基因组具有稳定性。
总体而言，本研究首次对突尼斯流行的B. melitensis菌株进行基因组调查，揭示了其遗传稳定性、抗菌药物敏感性和毒力因子特征，强调了区域监测和国际合作在布鲁氏菌病防控中的重要性，未来还需进一步研究布鲁氏菌的耐药和毒力遗传机制。
材料和方法
羊布鲁氏菌分离株
1988 年至 2022 年，在突尼斯斯法克斯的哈比卜?布尔吉巴大学医院微生物实验室，从人类样本中分离出 88 株B. melitensis。该医院服务于大量人口，从这些分离株中随机选取 24 株进行全基因组测序。这些菌株分别从血液（n = 21）、脓肿（n = 2）和心脏瓣膜（n = 1）中分离得到，其中 8 株经法国国家农业、食品和环境研究所（INRA）表型分析鉴定为生物变种 3。
全基因组测序和质量评估
按照生物安全规则，使用 QIAamp DNeasy 血液和组织方法从 24 个选定的B. melitensis样本中提取总基因组 DNA。在 Illumina NextSeq 500 或 NovaSeq 平台上进行 WGS，采用 2×150 bp 双端测序。使用 FASTQC 进行测序数据质量评估，用 Trimmomatic 去除接头和低质量 reads，利用 Kraken2 评估数据完整性以检查潜在的序列污染。以B. melitensis菌株 16M（Genbank 登录号 NC_003317 和 NC_003318）为参考基因组，通过 Burrow - Wheeler Aligner 和 SAMtools 计算理论覆盖率和平均读长覆盖度。使用 Shovill 进行基因组组装，QUAST 评估组装质量，Prokka 进行基因组注释。
基于 WGS 的基因分型
使用 Mash 进行物种确认，通过 pubMLST 确定布鲁氏菌分离株的多位点序列类型（MLST），采用 9 位点和 21 位点两种分型方案。利用基于 1,764 个核心基因的 PubMLST 平台对B. melitensis序列进行 cgMLST 分析。使用 Snippy 鉴定核心基因组 SNP（cgSNP），IQ - TREE 构建最大似然树，iTOL 进行可视化，pairsnp 计算基因组间的 SNP 距离，SnpEff 进行 SNP 注释。
与国际序列的比较
从 NCBI 基因组下载 128 个公开可用的B. melitensis序列，这些序列来自 24 个不同国家，基于前人研究分类及北非其他公开基因组进行选择。通过计算成对 SNP 差异和构建最大似然树评估研究菌株与国际序列的关系。
抗菌耐药性决定因素和毒力因子检测
通过 Resfinder 数据库、综合抗生素耐药数据库（CARD）和 NCBI AMRFinder Plus 筛选组装基因组中的抗菌耐药基因。利用 snpEff 检测rpoB、folA、folP、gyrA、gyrB、parC 和parE 基因中与耐药相关的氨基酸替换。通过 Abricate 利用毒力因子数据库（VFDB）确定潜在毒力基因。
